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番茄转录因子SlDREB2基因功能验证

作　者: 于国红
导　师: 程宪国
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物物理学
关键词: 番茄 SlDREB2 转录因子 Real-Time qPCR Virus Induced Gene Silencing
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究中，SlDREB2转录因子基因是本实验室利用通过酵母单杂交从番茄（丽春）cDNA文库中筛选得到，该基因共编码299个氨基酸，具有典型的DREB转录因子基因的结构特征。为确定该基因的功能，在亚细胞定位分析基础上，利用基因过表达以及VIGS基因沉默技术，分别研究了逆境胁迫条件下，该基因在拟南芥模式植物与番茄中的表达特征，并分析了相关的生理生化指标，明确了该基因在干旱、低温胁迫条件下的应答反应机制。研究为抗逆作物品种培育提供了理论与材料支撑，具有重要的科学应用价值。取得如下主要研究结果：1.生物信息学分析表明SlDREB2基因蛋白结构中有长度有58氨基酸组成的AP2/EREBP保守域，在N末端有一个酸性保守区为核定位信号区，在C末端分别有一碱性保守区转录激活区，是一个类属于AP2/EREBP家族的DREB转录因子。2.亚细胞定位结果表明：将16318hGFP::SlDREB载体转化拟南芥原生质体发现SlDREB2基因只在细胞核中表达，符合转录因子的表达特征。3.利用floral-dip法将pCAMBIA1304::SlDREB2植物过表达载体转化拟南芥，经抗性筛选和PCR扩增检测获得转基因阳性苗5株，经继代培养得到3个纯合株系； GUS组织染色分析表明，SlDREB2的表达部位主要集中在根部和子叶中，而在真叶中表达相对较少。4.生理指标测试表明：低温和干旱胁迫导致野生型和转基因型拟南芥植株丙二醛含量都升高，但转基因植株中丙二醛含量增加并不显著；转基因拟南芥中可溶性糖和脯氨酸的含量显著高于野生型； Real-time qPCR结果表明，转基因拟南芥中的目的基因SlDREB2的表达量都明显高于野生型拟南芥，转基因拟南芥中抗冻基因cor6.6的表达量要高于野生型拟南芥植株；在干旱胁迫条件下，转基因株系rd29A基因的表达量要明显高于野生型拟南芥株系。5.利用灌根和叶片注射法，成功地将携带SlDREB2基因的两个特异片段的VIGS重组载体pTV00::SlDREB2-1和pTV00::SlDREB2-2转化番茄,得到转基因番茄阳性植株；分析表明，干旱胁迫处理后，经过VIGS浸染后的番茄丙二醛含量明显高于野生型株系，而可溶性糖以及脯氨酸含量与野生型株系相比显著降低；Real-time qPCR分析结果表明VIGS效果明显，SlDREB2的表达在干旱、低温胁迫条件下受到明显抑制，并且SlDREB2保守域后边459bp的特异片段对植物抗逆性的调控更为重要。综上所述，本试验初步明确了该转录因子基因在干旱、低温条件下对植物抗性的提高具有调控功能，为进一步深入研究其分子调控机制奠定了理论基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-15
英文缩略表  15-16
第一章 绪论  16-25
  1.1 植物转录因子研究现状  16-18
    1.1.1 转录因子  16
    1.1.2 与植物抗逆相关的转录因子  16-18
    1.1.3 DREB 转录因子在植物抗逆性中的作用  18
  1.2 植物对非生物胁迫的应答机制  18-21
    1.2.1 低温胁迫下植物的应答特征  19-20
    1.2.2 植物应答干旱胁迫的特征  20-21
  1.3 基因沉默  21-23
    1.3.1 转录阶段基因沉默（TGS）机制  21
    1.3.2 转录后水平基因沉默（PTGS）机制  21
    1.3.3 VIGS 病毒载体的开发  21-22
    1.3.4 VIGS 的研究进展  22-23
  1.4 立题目的意义  23-24
  1.5 技术路线  24-25
第二章 SlDREB2 基因生物学分析与表达分析  25-34
  2.1 试验材料  25-26
    2.1.1 菌种及载体  25
    2.1.2 试剂  25
    2.1.3 引物合成与基因测序  25
    2.1.4 培养基的配制  25
    2.1.5 仪器设备  25
    2.1.6 生物信息分析软件  25-26
  2.2 SlDREB2 基因分析  26-29
  2.3 构建亚细胞定位载体  29-34
    2.3.1 亚细胞定位载体构建流程图  29
    2.3.2 亚细胞定位重组载体 PCR 和酶切验证  29-30
    2.3.3 SlDREB2 的亚细胞定位分析  30-34
第三章 转基因拟南芥和番茄阳性植株的获得  34-49
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 实验菌株  34
    3.1.2 模式植物  34
    3.1.3 实验试剂及试剂盒  34
    3.1.4 配制培养基  34
    3.1.5 配制溶液  34-35
    3.1.6 仪器设备  35
  3.2 实验方法  35-42
    3.2.1 构建植物过表达载体  35-38
    3.2.2 农杆菌转化  38-39
    3.2.3 Floral-dip 法转化拟南芥  39-40
    3.2.4 筛选携带 SlDREB2 基因的拟南芥植株  40
    3.2.5 构建 VIGS 重组载体  40-42
  3.3 结果与分析  42-49
    3.3.1 植物过表达载体 pCAMBIA 1304::SlDREB2 检测结果分析  42-43
    3.3.2 检测阳性农杆菌  43-44
    3.3.3 筛选转 SlDREB2 基因的拟南芥阳性植株  44
    3.3.4 PCR 检测携带 SlDREB2 拟南芥阳性植株  44-45
    3.3.5 转基因拟南芥的 GUS 组织染色分析  45-46
    3.3.6 构建 VIGS 重组载体结果分析  46-49
第四章 转基因拟南芥及番茄逆境生理分析  49-72
  4.1 材料  49
  4.2 实验所需溶液、试剂盒及仪器设备  49-50
    4.2.1 配制溶液  49
    4.2.2 试剂盒  49
    4.2.3 主要仪器设备  49-50
  4.3 方法  50-52
    4.3.1 拟南芥材料的处理  50
    4.3.2 逆境胁迫处理的拟南芥及番茄中生理指标的测定  50-51
    4.3.3 拟南芥中目的基因及抗逆相关基因的表达分析  51-52
  4.4 结果分析  52-72
    4.4.1 观察低温、干旱处理下拟南芥的表型变化情况  52-53
    4.4.2 MDA 含量在低温、干旱处理下拟南芥和番茄中的变化情况  53-55
    4.4.3 可溶性糖含量在低温、干旱处理下拟南芥和番茄中的变化情况  55-57
    4.4.4 脯氨酸含量在低温、干旱处理下拟南芥和番茄中的变化情况  57-59
    4.4.5 转基因拟南芥中相关基因的表达特征  59-72
第五章 结论  72-74
参考文献  74-79
致谢  79-80
作者简介  80

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 茄果类 > 番茄（西红柿）
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