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紫甘薯花色苷和咖啡酰类活性物质的分离、纯化与特性

作　者: 闫倩倩
导　师: 张雨青
学　校: 苏州大学
专　业: 生物物理学
关键词: 紫甘薯花色苷精提物咖啡酰抗氧化抗肿瘤乙醇肝保护
分类号: S531
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本论文以日本紫甘薯“菱紫”(Ayamurasaki)的块根为试验材料，采用微波烘烤-酸性电解水联合萃取的方法获得精提物，经AB-8大孔树脂吸附、醇水溶液洗脱后得到紫甘薯精提物。模型小鼠体内活性试验结果表明，紫甘薯精提物对小鼠S180肉瘤的生长具有显著的抑制作用，最高抑制率可接近80%；这种精提物对模型小鼠急性乙醇性肝损伤也有一定的预防保护作用，紫甘薯精提物治疗组能够有效地抑制模型小鼠体内血清ALT、AST水平的升高，同时明显促进肝脏组织GSH、GST、SOD、CAT水平升高，最高可达到甚至超过阳性对照水飞蓟宾处理组的水平，这说明紫甘薯精提物可能是通过提高小鼠的抗氧化能力而保护肝脏组织免受乙醇损伤的。本实验进一步采用半制备型高效液相色谱法对上述紫甘薯精提物中的主要活性成分进行了分离、纯化和制备，获得了十种单体组分，其中有五种组分水溶液呈红色，在可见光谱530nm处有强吸收。根据质谱分析获得的分子离子、分子碎片的波谱数据和有关报道的结果分析表明，这五种活性组分都是矢车菊素或芍药素酰化的葡萄糖苷类化合物，具体为3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃葡糖基}-[5-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)]矢车菊素；3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-阿魏酰-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃葡糖基}-[5-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)]矢车菊素；3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃葡糖基}-[5-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)]芍药素；3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-对羟基苯甲酰-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-D-吡喃葡糖苷}-[5-O-(β-D-吡喃葡萄糖苷)]芍药素；3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-阿魏酰-β-D-吡喃葡糖基]-β-D-吡喃葡糖苷}-[5-O-(β-D-吡喃葡糖苷)]芍药素。这五种紫甘薯花色苷组分色价各异，其中3-O-{6-O-(E)-咖啡酰-2-O-[6-O-(E)-阿魏酰-β-D-吡喃葡糖基]-β-D-吡喃葡糖基}-[5-O-(β-D-吡喃葡糖苷)]芍药素的色价最高，530nm处的色价值高达147，即该组分是紫甘薯花色苷中颜色最艳红的成分，这一结果对于今后作为绿色健康食品着色剂的紫甘薯新品种的培育有重要的参考价值。另五种非红色的成分经LC-MS、1H-NMR和13C-NMR波谱分析，鉴定为咖啡酰类物质，包括咖啡酰基奎宁酸和咖啡酰基二糖苷二类。在以往的报道中，5-咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-二咖啡酰基奎宁酸以花色苷结合的方式存在于紫甘薯中，没有在紫甘薯中分离到单体的报道；而咖啡酰基-β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃葡萄苷和反式4,5-二咖啡酰基奎宁酸在紫甘薯“菱紫”的块根中还是首次发现。体外抗氧化作用实验表明，这五种咖啡酰类物质的活性最高，其次为前五种花色苷类物质，而紫甘薯精提物最低。二苯代苦味酰肼(DPPH)自由基清除能力的活性试验表明，这些样品清除DPPH自由基能力较强，其IC50值在7.6~12.4μg/ml范围内。综上所述，紫甘薯精提物具有很强的抗肿瘤和保肝护肝作用。经过进一步纯化获得了五种呈红色的花色苷类化合物和五种非红色的咖啡酰类化合物，其中咖啡酰类组分具有更强的抗氧化活性和清除DPPH自由基的能力。本文的研究结果为紫甘薯或紫甘薯提取物作为健康食品或绿色食品着色剂的开发奠定了坚实的基础，为功能性紫甘薯新品种的培育提供了重要的依据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章文献综述  12-31
  1 紫甘薯概述  12-17
    1.1 紫甘薯的化学成分  12-14
      1.1.1 黄酮多酚类化合物  12-13
      1.1.2 紫甘薯多糖  13
      1.1.3 紫甘薯中游离氨基酸和矿物质  13
      1.1.4 蛋白质和多肽  13-14
      1.1.5 咖啡酸类成分  14
    1.2 紫甘薯的药理学作用  14-17
      1.2.1 抗氧化及清除自由基功能  14-15
      1.2.2 抗肿瘤活性  15
      1.2.3 降血糖功能  15-16
      1.2.4 抗突变  16
      1.2.5 改善肝功能  16-17
      1.2.6 其它功能  17
  2 黄酮类化合物  17-24
    2.1 黄酮类化合物概述  17-18
    2.2 黄酮类化合物提取技术的研究  18-20
      2.2.1 溶剂提取法  18
      2.2.2 碱提酸沉法  18-19
      2.2.3 热水提取法  19
      2.2.4 超声波法  19
      2.2.5 酶解法  19
      2.2.6 微波辅助提取法  19-20
      2.2.7 超临界流体萃取法  20
    2.3 黄酮类化合物的纯化  20-22
      2.3.1 大孔树脂吸附法  20-21
      2.3.2 柱色谱法  21-22
      2.3.3 溶剂萃取法  22
    2.4 黄酮的测定  22-23
      2.4.1 高效毛细管电泳法(highperformancecapillaryelectrophoresis)  22
      2.4.2 高效液相色谱  22-23
      2.4.3 质谱(MS)及液质联用  23
    2.5 化合物结构鉴定常用技术  23-24
      2.5.1 核磁共振技术  23-24
      2.5.2 光谱法  24
  3 花色苷色素  24-27
    3.1 花色苷研究现状  24-25
    3.2 花色苷颜色的表达方式  25-26
    3.3 pH值对花色苷光谱特征和颜色的影响  26-27
  4 咖啡酰奎宁酸(Caffeoylquinicacids,CQA)  27-30
    4.1 一取代咖啡酰奎宁酸类化合物  28-29
    4.2 二咖啡酰奎宁酸类化合物(DCQAs)  29
    4.3 其它咖啡酰奎宁酸类化合物  29-30
  5 立题意义和主要研究内容  30-31
第二章实验材料与方法  31-37
  1 实验试剂、材料及仪器  31-32
    1.1 主要仪器与设备  31
    1.2 试剂及材料  31-32
  2 实验设计与方法  32-37
    2.1 紫甘薯精提物的制备  32
    2.2 S180肿瘤小鼠模型的建立  32
    2.3 小鼠急性乙醇性肝损伤的建立  32-33
    2.4 高效液相色谱法(HPLC)分析  33
      2.4.1 样品配制  33
      2.4.2 色谱条件  33
    2.5 半制备高效液相色谱法(Pre-HPLC)制备活性物质  33-34
      2.5.1 样品配制  33
      2.5.2 色谱条件  33-34
    2.6 HPLC法分析纯度  34
    2.7 总抗氧化能力的测定（FRAP值测定）  34
    2.8 清除自由基能力的测定（DPPH值测定）  34-35
    2.9 还原力测定  35
    2.10 稳定性实验  35
    2.11 色价测定  35-36
    2.12 质谱分析  36
    2.13 核磁共振(NMR)  36-37
第三章实验结果分析与讨论  37-63
  1 紫甘薯精提物的制备与生物活性  37-43
    1.1 紫甘薯精提物的制备  37
    1.2 体外活性  37-41
      1.2.1 FRAP模型中总抗氧化能力  37-39
      1.2.2 紫甘薯精提物的还原力  39-40
      1.2.3 紫甘薯精提物对DPPH自由基的清除活性的分析  40-41
    1.3 体内活性  41-43
      1.3.1 紫甘薯精提物对S180肿瘤小鼠的肿瘤抑制作用  41-42
      1.3.2 紫甘薯精提物对小鼠乙醇性肝损伤的预防保护作用  42-43
  2 花色苷的分离制备、生物活性及其结构鉴定  43-52
    2.1 分离制备  43-45
      2.1.1 紫甘薯花色苷组分在半制备HPLC上的分离  43-44
      2.1.2 紫甘薯花色苷成分的收集  44
      2.1.3 紫甘薯花色苷成分的紫外-可见光谱吸收  44-45
    2.2 紫甘薯花色苷组分的色价  45-46
    2.3 紫甘薯花色苷随pH的稳定性变化  46-47
    2.4 紫甘薯花色苷的体外抗氧化活性  47-50
      2.4.1 FRAP模型中总抗氧化能力  47-48
      2.4.2 紫甘薯花色苷组分的还原力  48-49
      2.4.3 紫甘薯花色苷对DPPH自由基清除活性的分析  49-50
    2.5 紫甘薯花色苷结构分析鉴定  50-52
  3 咖啡酰类物质的生物活性与分子结构鉴定  52-63
    3.1 紫甘薯中非红色活性成分的制备  52-54
      3.1.1 紫甘薯中非红色活性物质在半制备HPLC-PAD上的色谱分离  52-53
      3.1.2 紫甘薯非红色单体的收集  53
      3.1.3 紫甘薯非红色单体的紫外-可见吸收光谱  53-54
    3.2 紫甘薯中非红色组分的的质谱分析  54
    3.3 紫甘薯中非红色组分的13C-NMR和1H-NMR鉴定  54-59
    3.4 紫甘薯咖啡酰类物质的体外抗氧化活性  59-63
      3.4.1 FRAP模型中总抗氧化能力  59-60
      3.4.2 紫甘薯咖啡酰类物质的还原力  60-61
      3.4.3 紫甘薯咖啡酰类物质的DPPH自由基清除活性  61-63
第四章讨论  63-64
第五章结论  64-66
参考文献  66-77
读研期间发表的文章及成果  77-78
附录  78-84
致谢  84-85
基金资助  85-86

紫甘薯花色苷和咖啡酰类活性物质的分离、纯化与特性

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