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基于4种抗生素抗性诱变的Xenorhabdus bovienii YL002菌株抑菌活性研究

作　者: 安欣
导　师: 王永宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 农药学
关键词: Xenorhabdus bovienii YL002 抗生素抗性诱变抑菌活性
分类号: S482.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

昆虫病原线虫共生菌的代谢产物中含有多种活性物质，在杀虫、抗菌、抗病毒、抗癌等方面都具有良好的表现，在农业、医药的多个方面都有广泛的应用，是一类具有较大开发潜力的微生物资源。Xenorhabdus bovienii YL002是从陕西杨凌筛选的昆虫病原线虫中分离得到的一株共生菌，前期研究已经确定其具有较强的抑菌活性，但从自然界中分离出的野生菌株普遍存在次生代谢物产量较低的现象，不利于对其进行深入的科学研究和大规模的工业化生产。本研究针对这一问题，采用紫外-吖啶橙复合诱变的方法对YL002菌株进行诱变改良，以4种抗生素为选择压，筛选抑菌活性有较大变化的突变菌株。并对筛选得到的突变菌株从抑菌活性变化、培养特征变化、DNA分子水平的差异3方面进行研究，得出了以下主要结果：1. YL002菌株通过紫外-吖啶橙复合诱变，在庆大霉素、链霉素、红霉素和氨苄青霉素最小抑制浓度的选择压力下，筛选得到对4种抗生素具有抗性的突变菌株89株，经过遗传稳定性验证，最终筛选出17株抑菌活性有较大变化并能够稳定遗传的突变菌。2.通过琼脂扩散法测定了17株抗性突变菌株对枯草芽孢杆菌的生长抑制作用，结果表明，有9株突变菌对枯草芽孢杆菌的生长抑制活性增大，其中突变株L0420-3的抑制效果最好，抑菌圈直径较野生菌株的增大率在80%以上；突变株L8、L2-1、L0314-4和H0408-6对枯草芽孢杆菌则几乎没有抑菌活性；采用生长速率法测定突变株对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制活性，其中突变株L0314-4的抑制率为74.85%，是野生菌株的1.33倍，而L0420-3的抑制率仅为50.60%，与野生菌株相比略有减小；采用盆栽试验测定突变株对油菜菌核病菌的防治效果，其中Q0104-1对油菜菌核病具有较好的防治效果， Q0104-1的防治效果为46.29%，是野生菌株的1.34倍，Q1220-3的防治效为40.02%，是野生菌株的1.16倍。3.突变菌的菌落的培养特征出现变化。X.bovienii YL002野生菌株菌落颜色为白色半透明，菌落潮湿，直径较小，边缘整齐，突变株Q025-2菌落颜色变为橙黄色，菌落直径增大，边缘出现褶皱；突变株Q025-7菌落颜色变为粉红色；突变株L0420-3菌落颜色变为白色，菌落干燥呈粉状，菌落内边缘凸起。突变株Q1207-1生长量明显减小，细菌对数生长期延后，生长稳定期大大提前。4.采用HPLC方法对5株抑菌活性有显著变化的突变株与野生菌株代谢谱差异性进行分析，结果显示突变株发酵液成分的含量、种类都发生了较大变化。5.研究采用AFLP分子标记方法对L0420-3和Q1207-1两株突变菌与野生菌株DNA的差异性进行了分析。结果表明，在所选用的64对选择性扩增引物中有48对引物共扩出条带1587条，其中突变株L0420-3和Q1207-1与野生菌株的共有条带数分别为328条和389条，多态性分别为53.08%和48.13%。48对引物组合中E4/M8对L0420-3扩增出的差异性条带数为14条；E5/M4对Q1207-1扩增出的差异性条带数为15条，其他引物组合扩增出的差异条带数均在4~10条之间，DNA水平上的变异情况在整个基因组中较为平均。突变菌L0420-3、Q1207-1与野生菌株的遗传相似系数分别为0.6388和0.6831，说明这两株突变菌有明显的遗传差异，DNA水平上发生了较大变异。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-27
  1.1 昆虫病原线虫共生菌初生型与次生型的差异  12-14
    1.1.1 染料吸收差异  13
    1.1.2 色素产生  13
    1.1.3 运动性差异  13
    1.1.4 菌毛  13
    1.1.5 抗生素产生能力  13-14
  1.2 昆虫病原线虫共生菌的代谢产物及生物活性  14-16
    1.2.1 杀虫活性物质  14-15
    1.2.2 抑菌活性物质  15-16
  1.3 菌种改良方法  16-20
    1.3.1 自然选育  16
    1.3.2 诱变育种  16-18
    1.3.3 代谢工程  18-19
    1.3.4 基因组改组  19
    1.3.5 表观遗传修饰  19-20
    1.3.6 核糖体工程  20
  1.4 核糖体工程研究进展  20-22
    1.4.1 链霉素抗性突变  20-21
    1.4.2 利福平抗性突变  21-22
  1.5 抗生素抗性筛选在菌株改良中的应用  22
  1.6 AFLP 分子标记技术  22-25
    1.6.1 AFLP 方法和基本原理  22-23
    1.6.2 AFLP 技术的主要特点  23-24
    1.6.3 AFLP 技术的应用  24-25
  1.7 问题的提出及主要研究内容  25-27
第二章材料与方法  27-36
  2.1 试验材料  27-28
    2.1.1 供试菌株  27
    2.1.2 供试植物  27
    2.1.3 培养基  27
    2.1.4 主要化学试剂及材料  27-28
    2.1.5 主要仪器设备  28
  2.2 研究方法  28-36
    2.2.1 菌株活化  28
    2.2.2 诱变条件的确定  28-29
    2.2.3 紫外-吖啶橙复合诱变及突变菌株的筛选  29
    2.2.4 抗性突变菌株对番茄灰霉病菌抑菌活性  29-30
    2.2.5 抗性突变菌株对油菜菌核病菌抑菌活性  30-31
    2.2.6 突变菌株发酵液成分差异比较  31-32
    2.2.7 突变菌株生长量差异  32
    2.2.8 突变菌株与野生菌株基因组 DNA 的 AFLP 分析  32-36
第三章结果与分析  36-48
  3.1 诱变条件的确定  36
  3.2 突变菌株筛选及遗传稳定性检测  36-37
  3.3 突变菌株对番茄灰霉的抑制活性  37-39
    3.3.1 突变菌株对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用  37-38
    3.3.2 突变菌株对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用  38-39
    3.3.3 突变菌株对番茄灰霉病的防治效果  39
  3.4 突变菌株对油菜菌核病菌的抑制活性  39-41
    3.4.1 突变菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用  39-40
    3.4.2 突变菌株对油菜菌核的防治效果（活体组织法）  40-41
    3.4.3 盆栽试验  41
  3.5 10 株突变菌对 7 种病原真菌菌丝生长的抑制效果  41-42
  3.6 突变菌株与野生菌株代谢谱差异性比较分析  42
  3.7 突变菌株与野生菌株细胞生长量比较  42-43
  3.8 突变菌株与野生菌株的培养特征  43-44
  3.9 突变菌株与野生菌株基因组 DNA 的 AFLP 分析  44-48
    3.9.1 DNA 提取结果  44
    3.9.2 DNA-AFLP 预扩增结果  44
    3.9.3 DNA-AFLP 选择性扩增引物筛选及多态性分析  44-48
第四章讨论  48-51
  4.1 抗生素抗性突变菌株的筛选  48-49
  4.2 突变菌株与野生菌株培养特征的比较  49
  4.3 突变菌株与野生菌株发酵液粗提物成分比较  49-50
  4.4 突变菌株与野生菌株 DNA-AFLP 分析  50-51
第五章结论  51-52
参考文献  52-58
附图  58-63
致谢  63-65
作者简介  65

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