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核盘菌菌核围微生物多样性分析及拮抗细菌筛选

作　者: 李晓辉
导　师: 李国庆
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 核盘菌菌核围 T-RFLP 微生物多样性盾壳霉拮抗
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

油菜在我国广泛种植,是重要的油料作物。油菜菌核病是我国油菜生产上的主要病害,在长江中下游地区发病尤为严重,影响了油菜产量和品质的提高。作为油菜菌核病的病原菌,核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)在田间主要以菌核的形式存在,侵染期会散放子囊孢子随气流传播,显然防治油菜菌核病有很大难度。由于缺乏高抗品种,农药使用也有诸多问题,生物防治逐渐成为研究热点。这其中盾壳霉因寄主专化、防治效果好等原因受到众多学者的青睐。由于核盘菌生活史中大多数时间是以菌核这种抗逆结构存活于土壤中,有人证明土壤中的微生物是影响菌核存活的主要因素；而盾壳霉施用后也是以孢子形式在土壤中存活,土壤中的微生物与盾壳霉之间的关系直接影响盾壳霉寄生菌核的效率。因而研究菌核周围土壤中的微生物对于防治油菜菌核病有巨大的理论价值和实际意义。定义距离菌核表皮3mm左右的土壤为菌核围土壤,将远离菌核(超过5cm)的土壤定义为非菌核围土壤。比较二者微生物种类与数量的差别,确定“菌核围效应”的存在。分离鉴定菌核围土壤中可培养的微生物,并研究其与核盘菌、盾壳霉三者间的互作,寻找能够增强和稳定盾壳霉防治效果的新途径。利用T-RFLP指纹图谱技术检测菌核围与非菌核围土壤中细菌和真菌的种类。通过对所有样品进行聚类分析及多样性分析发现,第13号样品因真菌多样性显著高于其他样品(D=0.91,E=0.92)而被单独列为1支。第10、19、22号样品中细菌物种丰度显著低于其他样品(D<0.67,E<0.61)；第3号样品单独1支,则是因其物种丰度较高(D=0.94,E=0.82)所致。多元线性回归分析结果显示,土壤样品中真菌种类变化与取样时间、取样地点(菌核围/非菌核围)和取样深度均无显著关联(P>0.05),细菌种类变化仅与取样深度显著相关(P=0.002),回归方程为y=11.208+3x。通过为期1年的连续采样,发现各个深度菌核围土壤含菌量与非菌核围土壤含菌量的变化并不完全一致,但在取样后期,无论变化趋势还是含菌量都趋于一致。各个深度菌核围土壤含菌量的变化也不尽相同,表层土壤含菌量变化规律不明显,5cm与10cm深度菌核围土壤含菌量的变化较为一致。定义菌核围与非菌核围土壤中微生物数量的比值为菌核围效应值,计算菌核围效应值发现菌核围土壤含菌量高于非菌核围土壤(菌核围效应值大于1)。分离菌核围土壤中可培养的细菌和真菌并进行鉴定,共得到7属21种细菌和7属12种真菌。细菌中8种属假单胞菌,6种属芽孢杆菌,3种为节杆菌,黄杆菌属、金黄杆菌属、伯克氏菌属、克雷伯氏菌属各1种。真菌中5种属青霉,2种属脉胞菌,剩余5种为米根霉、黑曲霉、黄白生赤壳菌、绿色木霉和葡萄座腔菌科真菌。选取所鉴定的21种细菌的代表菌株,分析其与核盘菌以及与盾壳霉的拮抗关系。通过PDA平板对峙培养,共得到17株对核盘菌有拮抗效果的细菌,有4株拮抗效果显著,其中a-B2、a-B9属芽孢杆菌,B4属假单胞菌,B11属节杆菌。共得到15株对盾壳霉菌丝生长有抑制效果的细菌,多数抑制效果强烈；还筛选到6株平板对峙培养时对盾壳霉几无拮抗效果的细菌,分别属于节杆菌(B9)、假单胞菌(B15、a-B20、d-B7)和芽孢杆菌(B16、a-B7)。经对比发现,对核盘菌拮抗效果强烈的细菌同样能够显著抑制盾壳霉生长；而对盾壳霉无抑制作用的细菌对核盘菌的拮抗效果都很差(抑菌带小于3mm)且不稳定。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章文献综述  12-21
  1 核盘菌的研究现状  12-14
    1.1 危害范围及程度  12
    1.2 生物学特性  12-13
    1.3 防治现状  13-14
  2 盾壳霉的研究现状  14-16
    2.1 生物学特性  14
    2.2 生态学特性  14-15
    2.3 盾壳霉寄生核盘菌的方式、机制以及影响因素  15
    2.4 盾壳霉寄生菌核的土壤生境  15-16
  3 土壤微生物多样性研究概况  16-20
    3.1 微生物富集现象研究进展  16
    3.2 微生物多样性的研究方法  16-20
      3.2.1 Biolog GN  17-18
      3.2.2 磷脂脂肪酸  18
      3.2.3 变性梯度凝胶电泳  18
      3.2.4 单链构象多态性  18-19
      3.2.5 末端限制性酶切片段长度多态性  19
      3.2.6 454焦磷酸测序  19-20
  4 研究目的和意义  20
  5 文章构成  20-21
第二章核盘菌菌核围土壤微生物的分子多样性研究  21-31
  1 材料与方法  21-25
    1.1 试验材料  21
    1.2 仪器设备及试剂  21-22
    1.3 试验方法  22-25
      1.3.1 菌核培养  22
      1.3.2 土样制备与菌核掩埋  22-23
      1.3.3 土壤总DNA提取  23
      1.3.4 PCR引物及退火温度筛选  23-24
      1.3.5 限制性内切酶筛选  24-25
      1.3.6 土壤DNA的T-RFLP分析  25
    1.4 数据处理  25
  2 试验结果  25-30
    2.1 PCR引物及退火温度筛选结果  25-26
    2.2 内切酶筛选结果  26-27
    2.3 总DNA的T-RFLP分析  27-30
      2.3.1 各样品中真菌种类与含量的变化  28-29
      2.3.2 各样品中细菌种类与含量的变化  29-30
  3 小结  30-31
第三章核盘菌菌核围土壤中微生物的时空动态研究  31-41
  1 材料与方法  31-33
    1.1 实验材料  31
    1.2 主要仪器  31
    1.3 培养基  31-32
    1.4 试验方法  32
      1.4.1 土壤样品制备  32
      1.4.2 微生物计数与分离  32
    1.5 数据处理  32-33
  2 实验结果  33-39
    2.1 土壤样品含菌量的时空变化  33-37
    2.2 菌核围效应值统计  37-38
    2.3 菌核围土壤样品含菌量与土壤含水量的相关性分析  38-39
    2.4 掩埋深度与埋藏时间对菌核围土壤微生物数量的影响  39
  3 小结  39-41
第四章菌核围土壤中可培养微生物的分离与鉴定  41-50
  1 材料与方法  41-45
    1.1 实验材料  41
    1.2 仪器设备  41-42
    1.3 试验方法  42-45
      1.3.1 待测菌株活化  42
      1.3.2 真菌形态观察与鉴定  42
      1.3.3 真菌分子鉴定  42-44
      1.3.4 细菌形态观察与鉴定  44
      1.3.5 细菌分子鉴定  44
      1.3.6 真菌与细菌的物种多样性分析  44-45
  2 试验结果  45-49
    2.1 真菌鉴定结果  45-46
      2.1.1 真菌形态鉴定  45
      2.1.2 真菌分子鉴定  45-46
    2.2 细菌鉴定结果  46-48
      2.2.1 细菌形态鉴定  46-47
      2.2.2 细菌分子鉴定  47-48
    2.3 土壤微生物多样性分析  48-49
  3 小结  49-50
第五章菌核围细菌分离物的拮抗性分析  50-55
  1 材料与方法  50-51
    1.1 实验材料  50
    1.2 试验方法  50-51
      1.2.1 菌株活化与培养  50
      1.2.2 细菌与核盘菌及盾壳霉的拮抗实验  50-51
    1.3 数据分析  51
  2 实验结果  51-54
    2.1 细菌对核盘菌的拮抗结果  51-52
    2.2 细菌对盾壳霉的拮抗结果  52-54
  3 小结  54-55
第六章全文总结与展望  55-57
  1 结论  55-56
  2 创新点  56
  3 展望  56-57
参考文献  57-67
致谢  67

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