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山东省大豆疫霉的鉴定及生物学特性研究

作　者: 代玉立
导　师: 高智谋
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉鉴定核糖体DNA转录间隔区雄器着生方式培养基
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann）是大豆上寄生性很强、经济危害性大的重要病原卵菌之一。本学位论文在对山东省大豆疫霉进行分离的基础上，对不同地理来源的大豆疫霉的形态学、可溶性蛋白电泳进行了鉴定，并对其核糖体DNA的ITS序列、培养基营养条件对大豆疫霉雄器着生方式及对菌丝生长速率的影响等方面进行了系统研究，主要研究结果如下：1山东省大豆疫霉的分离与分布研究从山东省的大豆田采集土样225份，采用叶碟诱捕法检测土样中的大豆疫霉。结果发现，在寿光市、日照市、莒南县、费县、邹城市、济宁市等6个县（市）的16份土样中检测到大豆疫霉，共分离到5株大豆疫霉菌株，在烟台、青岛、滨州、淄博、德州、济南、泰安、聊城、菏泽等9市的81份土样中没有检测到大豆疫霉。2山东省大豆疫霉的鉴定对山东省大豆田土样中分离的5株疫霉菌进行了形态学和菌体可溶性蛋白电泳鉴定，结果表明，该菌在利马豆琼脂培养基（LBA）上生长缓慢，菌丝致密、无隔，形成菌丝膨大体，近直角分支，分支处稍溢缩。水培后产生大量倒梨形的孢子囊，不形成乳突，通过内层出方式产生新孢子囊，游动孢子在孢子囊内形成，同宗配合，藏卵器球形，雄器大多数是侧生。供试的5个菌株的蛋白质电泳图谱与标准菌株7071的蛋白质电泳图谱基本相同，在迁移率（Rf）为0.08、0.09、0.11、0.13、0.15、0.18、0.28、0.30、0.32、0.34、0.45、0.52和0.57处5个菌株的蛋白质电泳图谱与标准菌株7071的蛋白质电泳图谱有13条共有主条带；供试菌株SD145、SD156、SD167、 SD191、SD224和标准菌株7071的菌株间蛋白带相似率分别为89.66%、100.00%、92.86%、96.30%、92.86%。结合形态学特征和菌体可溶性蛋白电泳鉴定，将这5株疫霉鉴定为大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann）。3山东省大豆疫霉的ITS序列分析采用卵菌核糖体基因内转录间隔区（ITS）通用引物，通过PCR扩增了7个Phytophthora sojae菌株（SD145、SD156、SD167、SD191、SD224、7071和AH13），结果表明：所有供试菌株均可得到一条大小约为1500bp且带型整齐一致的特异性扩增产物。再以大豆疫霉特异性引物对上述7个供试菌株进行PCR扩增并进行序列测定。利用MEGA4和SEAVIEW4软件中的UPGMA法对供试菌株和Genbank中已登录的P. sojae、P. medicaginis和P. trifolii等3个形态学种8个菌株的ITS碱基序列进行聚类分析。结果表明，供试的3个大豆疫霉（P. sojae）菌株的ITS序列均等长，且核苷酸的碱基序列完全相同。供试的3个大豆疫霉（P. sojae）菌株的ITS序列与Genbank中登录的AF228089和FJ801969的ITS序列的同源性高达100%。聚类结果表明，供试菌株SD145、SD191、AH13及GenBank中登录的大豆疫霉（P. sojae）AF228089、FJ801969和AY277278成一组，且遗传相似性极高；GenBank中登录的AF266799（P. medicaginis）和AF266800（P. trifolii）菌株为另一组，但是，AF266799（P. medicaginis）和AF266800（P. trifolii）2个菌株与其他6个菌株间的遗传亲源关系较远。4培养基营养条件对大豆疫霉雄器着生方式的影响本研究探讨了培养基营养条件对大豆疫霉（Phytophthora sojae）雄器着生方式的影响。结果表明，供试菌株SD191在利马豆培养基（LBA）、玉米粒培养基（MA）、大豆培养基（SBA）、胡萝卜培养基（CA）和番茄培养基（TA）上雄器大多侧生（其侧生比率分别为94.7%、88.3%、85.0%、84.3%和79.7%），而在燕麦培养基（OMA）上雄器主要是围生（其侧生比率为25.7%）。进一步对来自不同地区的菌株的测定结果是，在LBA上4个供试菌株的雄器均多为侧生（侧生比率分布范围为82.0%-94.7%，平均87.9%），而在OMA上则多为围生（侧生比率分布范围为19.7%-42.3%，平均29.7%），且雄器侧生比率随着OMA浓度的降低而上升（在1/4量的OMA上雄器侧生比率上升为71.0%），而随着LBA浓度的降低而下降，在1/4量的LBA上雄器侧生比率下降为64.3%。上述结果表明，培养基营养条件显著影响大豆疫霉雄器侧生和围生性状的表达。5培养基营养条件对菌丝生长速率的影响本研究探讨了培养基营养条件对大豆疫霉（Phytophthora sojae）菌丝生长速率的影响。结果表明，大豆疫霉菌株SD145在燕麦培养基（OMA）上生长速率最快，平均为11.20mm/d；而在大豆培养基（SBA）上生长速率最慢，平均为1.88mm/d。在玉米粒琼脂培养基(MA)、利马豆培养基（LBA）和西红柿培养基(TA)上生长速率较为平均，分别为9.30mm/d、8.88mm/d和8.22mm/d，而在胡萝卜培养基（CA）上生长速率次之，平均为5.47mm/d。进一步研究了不同培养基及浓度对大豆疫霉菌丝生长速率的影响，结果表明：在较高浓度的燕麦培养基（OMA）上菌丝生长速率最快，平均为11.20mm/d，但在1/4量水平上其生长速率明显下降，平均为6.30mm/d；而在较高浓度的利马豆培养基（LBA）上菌丝生长速率较慢，平均为8.88mm/d，但是随着利马豆培养基浓度的降低，其生长速率迅速增加，在1/4量水平上其生长速率达到平均9.55mm/d。实验结果进一步证明，培养基营养成分含量对大豆疫霉菌丝生长速率亦有显著影响。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-13
文献综述  13-22
  1 大豆疫病概述  13-16
    1.1 发生与危害  13
    1.2 病原物  13-14
    1.3 症状  14
    1.4 寄主范围  14
    1.5 生活史  14-15
    1.6 防治  15-16
  2 大豆疫病菌的分类与分离  16-18
    2.1 分类和命名  16-17
    2.2 大豆疫霉的分离  17-18
  3 大豆疫霉的鉴定  18-22
    3.1 常规的形态学鉴定  19
    3.2 菌丝体可溶性蛋白鉴定  19-20
    3.3 分子生物学鉴定  20-22
引言  22-25
材料与方法  25-36
  1 山东省大豆疫霉的采集与分离  25-26
    1.1 土样的采集  25
    1.2 培养基  25
    1.3 杀菌剂  25
    1.4 供试大豆叶片的准备  25
    1.5 土样分离方法  25-26
  2 山东省大豆疫霉的鉴定  26-30
    2.1 供试菌株  26
    2.2 菌丝、孢子囊的诱发及形态观察  26-27
    2.3 有性器官的形态观测  27
    2.4 菌体可溶性蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  27-30
  3 山东省大豆疫霉的 ITS 序列分析  30-33
    3.1 供试菌株、培养条件及基因组 DNA 提取  30-31
    3.2 菌丝的培养  31
    3.3 基因组 DNA 的提取及检测  31-32
    3.4 PCR 扩增的引物  32
    3.5 酶与试剂  32
    3.6 主要仪器设备  32-33
    3.7 PCR 反应体系及扩增程序  33
    3.8 分析软件  33
  4 营养条件对大豆疫霉雄器着生方式的影响  33-35
    4.1 供试菌株  33-34
    4.2 供试培养基  34-35
    4.3 雄器着生方式的检测  35
  5 培养基营养条件对菌丝生长速率的影响  35-36
    5.1 供试菌株  35
    5.2 供试培养基  35
    5.3 菌丝生长速率的测定  35-36
结果与分析  36-51
  1 山东省大豆疫霉的分离与分布研究  36-37
    1.1 山东省大豆疫霉分离结果  36
    1.2 山东省大豆疫霉分布研究  36-37
  2 山东省大豆疫霉的鉴定  37-40
    2.1 大豆疫霉形态学鉴定  37-38
    2.2 大豆疫霉体可溶性蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定  38-40
  3 山东省大豆疫霉的 ITS 序列分析  40-44
    3.1 大豆疫霉 DNA 的提取与检测  40
    3.2 大豆疫霉 rDNA-ITS 的 PCR 扩增  40-41
    3.3 大豆疫霉 ITS 序列比较  41-43
    3.4 疫霉菌的 ITS 序列聚类分析  43-44
  4 营养条件对大豆疫霉雄器着生方式的影响  44-47
    4.1 不同种类的培养基对大豆疫霉 SD191 雄器着生方式的影响  44
    4.2 不同来源的大豆疫霉在 LBA 和 OMA 培养基上的雄器侧生比率  44-45
    4.3 不同浓度的 LBA 和 OMA 培养基对大豆疫霉雄器侧生比率影响  45-47
  5 培养基营养条件对菌丝生长速率的影响  47-51
    5.1 不同培养基对大豆疫霉菌丝生长速率的影响  47-50
    5.2 不同培养基及浓度对大豆疫霉菌丝生长速率的影响  50-51
讨论  51-55
  1 山东省大豆疫霉的分离与分布研究  51
  2 山东省大豆疫霉的鉴定  51-52
  3 山东省大豆疫霉的 ITS 序列分析  52-53
  4 营养条件对大豆疫霉雄器着生方式的影响  53-54
  5 培养基营养条件对菌丝生长速率的影响  54-55
结论  55-57
  1 山东省大豆疫霉的分离与分布研究  55
  2 山东省大豆疫霉的鉴定  55
  3 山东省大豆疫霉的 ITS 序列分析  55-56
  4 营养条件对大豆疫霉雄器着生方式的影响  56
  5 培养基营养条件对菌丝生长速率的影响  56-57
参考文献  57-62
致谢  62-63
作者简介  63
[附] 攻读硕士学位期间已发表的学术论文  63

山东省大豆疫霉的鉴定及生物学特性研究

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