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肠球菌素SAU-2的纯化和特性研究

作　者: 周佳
导　师: 刘书亮
学　校: 四川农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 细菌素肠球菌纯化特性结构基因
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乳酸菌素是“公认安全(GRAS)”的乳酸菌产生的一类有抑菌活性的多肽或多肽前体,因具有安全、高效、无残留、无毒副作用和无耐药性等特点,引发了研究热潮。迄今已逾百种乳酸菌素被发现,但广泛应用的乳酸菌素仅有Nisin。而Nisin只在酸性条件下才有抑菌活性,严重限制了它的应用。因此,开发高效、广谱、稳定性良好的乳酸菌素具有重要意义。本文从分离自川西高原奶渣的34株疑似乳酸球菌中筛选产细菌素菌株,以藤黄微球菌10209(Micrococcus luteus)为指示菌,采用打孔法检测发酵上清液抑菌活性,复筛排除有机酸和H2O2干扰,检测蛋白酶敏感性,测定抑菌物质盐析液和粗提液抑菌活性,最终确定菌株SAU-2是细菌素产生菌。根据形态、生理生化指标和16S rDNA系统发育分析,将其鉴定为Enterococcus。肠球菌SAU-2的溶血性表型阳性,agg、gelE、cylM、cylB、cylA、esp、efaAfm、cpd、cob、ccf、cyILL、cyILs、fsrB和hyLEfm等毒力因子基因型阴性,表明肠球菌SAU-2是安全的。目前尚未见从奶渣中筛选产细菌素乳酸菌的报道。分别采用硫酸铵盐析法、pH吸附法和超滤法对肠球菌素SAU-2进行粗提。通过选择,最终确定90%饱和度(NH4)2SO4盐析提取细菌素。该细菌素的纯化分为三步：第一步收集离心上清液；第二步采用90%饱和度(NH4)2SO4进行盐析,透析浓缩得到粗提液；第三步将粗提液浓缩至适宜浓度用于SP Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱分析,分别采用含0.5%NaCl、1.5%NaCl和3.0%NaCl的洗脱液洗脱,收集最大活性峰进行透析浓缩,最终细菌素纯化倍数为10.79倍,回收率为17.27%。Tricine-SDS-PAGE确定细菌素分子量约为4350 Da。分别设计合成了多个肠球菌素结构基因的特异性引物,经PCR扩增,仅有enterocin L50A结构基因的特异性引物扩增出了一条大小约为200 bp的基因片段。该片段经纯化、T克隆测序后,序列同源性比对显示肠球菌素SAU-2结构基因序列和氨基酸序列与肠球菌素MR10A相应序列的相似性较高。上述研究表明肠球菌素SAU-2是细菌素家族的新成员。细菌素不同纯化阶段样品的特性研究表明,该细菌素具有很好的耐酸碱性,发酵上清液显示活性的pH值为2～9,盐析液为2～10,粗提液为2～12。该细菌素对热很稳定,经121℃处理20min,细菌素发酵上清液、盐析液和粗提液残留的活性分别为原液的92%、97%和96%。其对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感,不被木瓜蛋白酶和胃蛋白酶失活。其对测试的7株乳酸菌和8株G+细菌有抑菌作用,除对1株铜绿假单胞菌和1株红酵母有抑菌活性外,对其余G-细菌和真菌无抑制作用,与大多数乳酸菌素抑菌谱类似。细菌素发酵上清液、盐析液和粗提液的抑菌谱基本一致,且盐析液和粗提液的抑菌活性几乎都高于发酵上清液。表明随着细菌素纯化的进行,细菌素抑菌活性不断增强。肠球菌素SAU-2对单核细胞增生李斯特氏菌GIM1.228 (Listeria monocytogenes)的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)分别为256 AU/mL和512AU/mL。其对该敏感菌的作用方式为杀菌,且具有很强的杀菌能力。论文研究结果不但可为深入研究肠球菌素SAU-2的结构、作用机理和克隆表达奠定基础,而且可为其作为天然食品保鲜剂提供有价值的参考数据,具有一定的理论意义和实际应用价值。

肠球菌素SAU-2的纯化和特性研究

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