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miRNA-132-3p对大鼠成骨细胞功能的抑制作用研究

作　者: 胡泽兵
导　师: 张舒; 王冰; 曹新生
学　校: 第四军医大学
专　业: 航空、航天与航海医学
关键词: 模拟失重尾部悬吊大鼠模型成骨细胞 miRNA
分类号: R852.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

对于保持在地面正常重力环境下建立起来的机体内环境的稳态平衡而言，长期航天飞行将是一个严峻的挑战。在航天飞行中，失重环境引起的机体内环境稳态失衡常会诱发多个系统的功能改变，主要包括心血管系统、免疫系统、神经系统等生理系统的适应性功能改变以及骨骼系统、肌肉系统的长期持续性功能变化。数百万年来，人体骨骼系统的动态重建过程已经适应了正常重力环境的影响，且对于重力环境的变化极为敏感。失重环境打破了骨重建过程中骨形成与骨吸收之间的平衡，使得骨吸收多于骨形成，导致承重骨发生持续性骨质丢失，而且这种骨质丢失没有自限性，随着暴露时间的延长呈逐渐加重趋势，严重影响着航天员的健康。目前，失重性骨质丢失的机制尚不明确，已有的实验结果提示失重性骨质丢失的主要原因是成骨细胞功能下降。作为骨形成过程中的主要功能细胞，成骨细胞在分化过程中受到多种转录因子调控，miRNA就是其中一种重要的基因转录后调控因子。miRNA是一种22个核苷酸左右的单链非编码小RNA，它可以通过精细调控基因表达而广泛参与到细胞的各种生物学过程中去。目前，已有多种miRNA被确认在成骨细胞分化和骨骼形成中起到重要的调控作用。但是，在失重性骨质丢失研究领域，却鲜见相关miRNA研究报道。本课题组采用尾吊大鼠模型模拟失重生物效应，利用芯片技术检测尾吊组与对照组之间股骨miRNA的差异表达情况，选出差异表达显著的miRNA进行细胞学验证，然后通过细胞内过表达或者降低目标miRNA表达来研究其对成骨细胞功能的影响及其所参与的信号通路。本研究的主要发现和结果如下：1.模拟失重导致股骨组织miRNA表达谱改变。我们将3月龄SD雄性大鼠尾部悬吊3周后，使用“Agilet大鼠小RNA芯片”对提取的股骨总RNA进行检测，共筛选出26种差异表达显著的miRNA，其中14种miRNA表达降低，12种miRNA表达升高。然后对差异倍数在两倍以上的miRNA进行了q RT-PCR验证，结果显示，包括miRNA-132-3p、miRNA-139-3p、miRNA-2985、miRNA-487b、miRNA-339-3p、miRNA-33等在内的多种miRNA的表达趋势与芯片结果一致，这为我们寻找模拟失重下参与调控成骨细胞功能变化的miRNA提供了筛选范围。进一步在2D回转器模拟失重条件下培养的大鼠原代成骨细胞上进行验证，应用q RT-PCR检测上述候选miRNA的表达变化，其中miRNA-132-3p表现为先升高后回落的变化趋势：回转24h后表达升高1.46倍，回转48h后升高2.11倍，回转72h后回落至1.25倍，回转96h后趋于正常；其变化特点与动物学实验结果相符。实验结果表明模拟失重可以导致大鼠股骨组织相关细胞的miRNA表达谱发生变化，而miRNA-132-3p可能与模拟失重导致的成骨细胞功能抑制存在一定关系。2. miRNA-132-3p抑制成骨细胞的增殖、分化和矿化能力。向大鼠原代成骨细胞内转染miRNA-132-3p的mimic和inhibitor及其相应的阴性对照N.C.，实现细胞内miRNA-132-3p的过表达和降低表达，研究其对成骨细胞功能的影响。分别应用CCK-8法、q RT-PCR、Western blotting、ALP底物显色反应以及茜素红钙化结节染色等方法来评价转染后成骨细胞功能变化，结果显示，转染miRNA-132-3p mimic组的细胞数量与正常对照组和N.C.对照组相比均显著下降，成骨细胞特异性分化标志物和特异性转录因子ALP、Runx2和Osx的表达水平显著降低，ALP活性下降约30%；矿化结节数量明显减少。而转染inhibitor后所得结果与转染mimic后结果相反，进一步验证了miRNA-132-3p对成骨细胞的调控作用。本实验结果提示miRNA-132-3p可以抑制成骨细胞的增殖、分化和矿化能力。3. miRNA-132-3p通过抑制EP300的表达而参与成骨细胞分化调控。miRNA通过与靶基因3’UTR的靶点结合而抑制靶基因的蛋白翻译，进而调控细胞生物学过程。我们应用TargetScan和PITA两种常用靶基因预测软件预测miRNA-132-3p的靶基因，取两者预测结果的交集作为候选靶基因进行后续验证。预测显示BTG2、COLQ、EP300、PXN、SOX4、TIMM9、HMGA2、ID2等数十种基因的3’UTR存在miRNA-132-3p的潜在结合靶点，结合成骨细胞功能，我们选定SOX4、EP300、TIMM9和ID2四个潜在靶基因进行双荧光素酶报告基因实验验证，结果证实EP300和TIMM9是miRNA-132-3p的作用靶基因。结合文献报道，我们重点对EP300进行了深入研究：转染miRNA-132-3p的mimic之后，大鼠原代成骨细胞内的EP300的mRNA转录没有出现明显变化，但是蛋白表达却显著降低，这与模拟失重条件下，成骨细胞中EP300的蛋白表达变化一致。而应用siRNA技术沉默大鼠原代成骨细胞中EP300的表达，可以抑制成骨细胞的分化过程，说明miRNA-132-3p可能通过抑制EP300的蛋白翻译而抑制成骨细胞的分化。综上所述，我们研究了模拟失重条件下大鼠股骨组织miRNA的表达变化，首次发现miRNA-132-3p可以调控成骨细胞的功能。miRNA-132-3p可通过阻碍EP300的蛋白表达而降低EP300与Runx2的协同调控作用，抑制成骨细胞的分化过程。miRNA-132-3p参与模拟失重条件下成骨细胞功能变化的调控，这为进一步阐明失重性骨质丢失的细胞学机制提供了实验支持。

miRNA-132-3p对大鼠成骨细胞功能的抑制作用研究

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