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中国黄酒中氨基甲酸乙酯控制策略及机制的研究

作　者: 刘俊
导　师: 徐岩
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 黄酒氨基甲酸乙酯快速测定脲基乙醇酸酰胺水解酶功能性材料直接减除
分类号: TS262.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

“民以食为天，食以安为先。”发酵饮料酒中存在微量氨基甲酸乙酯（EC），对人体健康有潜在不利影响。各酿造酒中，黄酒的EC问题较为突出。在分析探讨各种EC含量控制策略过程中，以黄酒适用肠杆菌（Enterobacter sp.）R-SYB082尿素降解酶，形成从源头上控制中国黄酒中EC的有效措施，同时结合材料科学与技术，形成采用功能性材料进行黄酒中EC直接去除的技术，首次建立了对底物尿素和产物EC含量的集成控制策略，使中国黄酒中EC达到限量要求，对丰富中国黄酒的酿造科学和安全性理论与技术有重要的意义和价值。主要结果如下：（1）针对目前黄酒中EC传统检测方法存在的耗时、不够稳定、需有机溶剂等问题，基于顶空-固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC-MS），建立了自动化、快速简便测定黄酒中EC的方法。以氨基甲酸丙酯（nPC）为内标，添加NaCl至0.39g mL-1酒样，采用聚丙烯酸酯（PA）萃取头70℃下萃取45min。此法解决了黄酒中复杂化合物易形成干扰的问题，无需繁琐的预处理过程，自动快速高效，连续分析中单个样品的平均总需时，从国际标准SPE（固相萃取）法的2h以上缩短到只要57min，相对标准偏差小于2.89％，检测限低至1.19μg L-1，且无有机溶剂危害，推荐作为黄酒中EC含量测定的标准方法之一。（2）针对Enterobacter sp. R-SYB082尿素降解酶活力低的问题，通过优化发酵策略，包括优化初糖浓度为40g L-1、通入CO2提高反应器的厌氧水平等，Enterobacter sp.R-SYB082的尿素降解酶活从1100U L-1优化提高到2303U L-1，并放大至30L规模获得相似酶活。此Enterobacter sp. R-SYB082酶具有好的稳定性，且通过自然冷藏及CO2气体介入成功获得激活。该酶在黄酒中的尿素去除率（66.47%），比广泛使用的日本商业脲酶（去除率58.79%）高。该酶对黄酒中底物尿素的有效降解，从源头上实现了对EC的控制。（3）开展了对Enterobacter sp. R-SYB082尿素降解酶克隆表达的研究。通过基因比较发现，Enterobacter sp. R-SYB082酶是一种酸性脲酶同功酶——脲基乙醇酸酰胺水解酶（UAH）而非脲酶，该酶能实现黄酒中待去除底物尿素及产物EC的联合控制，具有很好的应用特性与工业开发前景。首次报道了脲酶缺陷型菌株以此酶介导的全新氮同化代谢途径。并成功构建了具有自主知识产权的工程菌BL21-pET28-allA，获得该酶的活性表达。（4）基于定向去除技术和分子间作用原理，从各种吸附性材料中优选得特异性功能材料L，以直接去除黄酒中EC。并对去除机制进行研究发现：其强碱性［-N+R3］基团对EC的离子交换作用，是EC定向减除的主要动力。经定向修饰和复配后，再经酒样的特殊工艺微调处理，其能选择性地有效减除黄酒中的EC。此减除为吸热过程，实际应用中温度需高于20℃效果更佳。应用L材料动态处理的较合适速度为0.25BV h-1，对于EC含量在300μg L-1以内的黄酒，能降至50μg L-1以下，达到限量要求；且处理后酒体的风味与原酒接近。配合Enterobacter sp. R-SYB082尿素降解酶对尿素的降解，和功能性材料对EC的终端定向减除，可以实现中国黄酒中尿素含量降至10mg L-1以内，以及EC含量在300μg L-1以内的黄酒降至50μg L-1以下，两者综合，首次建立了从底物到产物对黄酒中EC含量的集成控制策略。为中国黄酒中EC含量的降低，提供了实用、便捷的新途径，具有保障食品安全、利于应对国外技术壁垒的特殊含义。也为其他饮料酒中EC的控制，提供了一条新思路。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章绪论  10-24
  1.1 概述  10-16
    1.1.1 黄酒面临的氨基甲酸乙酯食品安全问题  10
    1.1.2 氨基甲酸乙酯介绍及其致癌性  10-11
    1.1.3 黄酒中 EC 控制的重要性和迫切性  11-13
    1.1.4 发酵饮料酒中 EC 的形成机理  13-15
    1.1.5 黄酒独特生产工艺与 EC 生成的关系  15-16
  1.2 国内外控制饮料酒中 EC 含量的主要途径  16-22
    1.2.1 酸性尿素降解酶的降解机制及其应用  17-20
    1.2.2 低产尿素酵母的代谢途径  20
    1.2.3 生产工艺过程调节与控制  20-21
    1.2.4 酸性 EC 酶降解 EC 思路  21-22
  1.3 当前饮料酒中 EC 测定方法的比较  22-23
  1.4 论文的思路与主要研究内容  23-24
第二章顶空-固相微萃取-气质联用技术快速测定黄酒中氨基甲酸乙酯的方法研究  24-35
  2.1 前言  24
  2.2 材料与方法  24-25
    2.2.1 试剂  24
    2.2.2 仪器与设备  24
    2.2.3 标准溶液的配制  24-25
    2.2.4 研究方法  25
  2.3 结果与讨论  25-33
    2.3.1 固相微萃取头的选择  25-27
    2.3.2 萃取条件对 EC 萃取效率的影响  27-29
    2.3.3 酒样糖度和焦糖色添加量对 EC 萃取效率的影响  29-30
    2.3.4 酒样酒精度对 EC 测定的影响  30-31
    2.3.5 标准曲线和线性范围  31-32
    2.3.6 方法的回收率和精密度  32
    2.3.7 与 EC 测定国标仲裁法的一致性分析  32-33
    2.3.8 实际酒样测定  33
  2.4 小结  33-35
第三章 Enterobacter sp. R-SYB082 发酵产酸性尿素降解酶及其尿素降解特性的研究  35-49
  3.1 前言  35
  3.2 材料与方法  35-38
    3.2.1 菌种  35
    3.2.2 主要试剂  35
    3.2.3 主要仪器  35-36
    3.2.4 研究方法  36-38
  3.3 结果与讨论  38-48
    3.3.1 酶在细胞上的分布定位  38-40
    3.3.2 发酵策略提高菌体生长和产酶  40-42
    3.3.3 发酵规模放大验证  42-43
    3.3.4 酶的激活特性研究  43-45
    3.3.5 酶在黄酒中的应用效果评估以及激活效果验证  45-47
    3.3.6 Enterobacter sp. 酶与商业脲酶降解尿素特性的研究  47-48
    3.3.7 降低底物尿素对 EC 的控制效果  48
  3.4 小结  48-49
第四章 Enterobacter sp. R-SYB082 酸性尿素降解酶基因及其克隆表达  49-69
  4.1 前言  49
  4.2 材料与方法  49-54
    4.2.1 菌株及质粒  49
    4.2.2 主要试剂  49-50
    4.2.3 主要仪器  50
    4.2.4 研究方法  50-54
  4.3 结果与讨论  54-68
    4.3.1 目标酶编码序列在细胞内的定位  54-55
    4.3.2 脲酶基因未获得的结果解析  55-57
    4.3.3 一种酸性脲酶同功酶的发现  57-59
    4.3.4 脲基乙醇酸酰胺水解酶的克隆  59-66
    4.3.5 脲基乙醇酸酰胺水解酶的表达  66-68
  4.4 小结  68-69
第五章黄酒中氨基甲酸乙酯直接减除技术研究  69-92
  5.1 前言  69
  5.2 材料与方法  69-73
    5.2.1 酒样  69-70
    5.2.2 材料  70
    5.2.3 主要试剂  70-71
    5.2.4 主要仪器  71
    5.2.5 研究方法  71-73
  5.3 结果与讨论  73-91
    5.3.1 功能性材料初筛  73-74
    5.3.2 功能性材料复筛  74-75
    5.3.3 功能性材料的特异性 EC 减除机理解析  75-78
    5.3.4 功能性材料的定向修饰  78-80
    5.3.5 材料的复配增效  80-81
    5.3.6 温度、添加量和处理批次对材料处理效果的影响  81-84
    5.3.7 材料的低温（10 ℃）钝化  84
    5.3.8 特殊工艺微调显著提高减除效果  84-85
    5.3.9 黄酒中 EC 的动态减除  85-88
    5.3.10 EC 处理小试设备及其 EC 减除效果  88-89
    5.3.11 EC 减除后酒样的综合评价  89-91
  5.4 小结  91-92
主要结论与展望  92-94
  主要结论  92-93
  展望  93-94
论文主要创新点  94-95
致谢  95-96
参考文献  96-109
附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文  109

中国黄酒中氨基甲酸乙酯控制策略及机制的研究

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