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中国优良酒酒球菌精氨酸代谢安全性的研究

作　者: 孔迎
导　师: 李华
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酒酒球菌氨基甲酸乙酯 GC/MS
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate, EC)早在1943年就被证实是一种多位点致癌物,可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等多种疾病,国际癌症研究所把EC对人类的致癌毒性归为2B群。包括葡萄酒在内的发酵饮料和发酵食品中均含有微量的EC。加拿大的卫生与预防部门规定佐餐葡萄酒中EC含量不得超过30μg/L;美国食品和药品管理局(US FDA)规定1988年以后生产的佐餐葡萄酒(酒精度≤14%v/v)EC含量不能超过15μg/L。氨基甲酸乙酯已经成为2002年联合国粮农组织重点监控物质,并制定了国际标准,其含量不得超过20μg/L。葡萄酒酿造中,在酒精发酵结束后,一般要进行苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)。MLF是在苹果酸-乳酸菌(Malolactic bacteria, MLB)的作用下,将双羧基的L-苹果酸脱羧基转变成单羧基的L-乳酸的过程。MLF在降低葡萄酒酸度、改善葡萄酒风味和增加葡萄酒微生物稳定性等方面具有重要意义,是生产优质红葡萄酒和部分白葡萄酒必须进行的工艺(Versari,1999;李华,2000)。有关葡萄酒MLB降酸的研究虽然很多,但是对MLB降酸之外的其它生物学特性的研究却较少。近年来的研究表明,MLF结束后MLB的精氨酸代谢对葡萄酒质量有重要影响,尤其是MLB的精氨酸代谢会导致中间代谢物瓜氨酸的分泌,瓜氨酸和乙醇自发反应生成致癌物氨基甲酸乙酯,严重影响葡萄酒的饮用安全性。酒酒球菌(O.oeni)是用于MLF最主要的菌株。本研究的目的在于对西北农林科技大学葡萄酒学院从山东、河北、陕西等地的葡萄酒产区筛选并保存的23株优良O. oeni进行精氨酸代谢安全性的研究,了解其菌株酿酒特性的安全性,对提高其在国际上的竞争力具有重大的理论和实践意义。研究结果如下:一、接种23株O.oeni的模拟酒在苹果酸-乳酸发酵过程中,均代谢精氨酸产生瓜氨酸。模拟酒中精氨酸含量在发酵过程中随着时间的增加逐渐降低,而瓜氨酸和鸟氨酸的含量随着时间的增加逐渐增加,最终达到最高值,然后趋于下降,这说明在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中,23株O.oeni均降解精氨酸导致中间代谢物瓜氨酸的分泌,瓜氨酸进而可能和乙醇发生反应,产生致癌物EC。二、本试验在进行EC含量的检测时,考虑到试验条件、试验准确性及试验成本等问题,采用了固/液萃取结合GC/MS分析方法。结果显示,本方法在EC含量为0-150μg/L范围内,得回归方程为Y=1.623x+0.003,线性相关系数R2=0.999,回收率在82.67-88.71%之间,回收率比较高,用于葡萄酒中EC含量的常规分析结果可靠。三、23株O.oeni在模拟酒中经苹果酸-乳酸发酵过后,检测其所产生的EC含量及其潜在EC含量,其中最高含量为1.32μg/L,最低为0.41μg/L,均远小于2002年联合国粮农组织制定的EC含量标准20μg/L,因此,从精氨酸代谢产生致癌物EC的角度来说,这23株O.oeni完全符合国际标准,具有较高的安全性。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-27
  1.1 EC 的研究进展  12
  1.2 EC 的致癌作用  12-14
    1.2.1 EC 的物理化学性质  12-13
    1.2.2 EC 的致癌机理  13
    1.2.3 EC 的致癌风险评估  13-14
  1.3 葡萄酒中EC 的形成过程  14-22
    1.3.1 葡萄酒酵母的尿素循环途径  15-17
      1.3.1.1 酵母对精氨酸转运和代谢机理  16
      1.3.1.2 降低尿素分泌的酵母工程菌的研究  16-17
    1.3.2 葡萄酒MLB 的精氨酸脱亚氨基酶途径  17-22
      1.3.2.1 MLB 精氨酸代谢途径  17-20
      1.3.2.2 精氨酸转运机制  20-21
      1.3.2.3 精氨酸代谢和酶合成的调节  21-22
    1.3.3 其它途径  22
  1.4 影响葡萄酒中EC 含量的因素  22-24
    1.4.1 葡萄汁中精氨酸的含量  22-23
      1.4.1.1 葡萄园施肥  22-23
      1.4.1.2 地面覆盖作物  23
      1.4.1.3 葡萄栽培品种和砧木  23
      1.4.1.4 葡萄汁营养添加剂  23
    1.4.2 带酒脚陈酿  23
    1.4.3 运输和贮存中的温度  23-24
  1.5 降低葡萄酒中EC 含量的措施  24-25
    1.5.1 葡萄园管理  24
    1.5.2 酵母菌株的选育  24
    1.5.3 苹果酸-乳酸菌（MLB）的选育  24
    1.5.4 酿造工艺  24
    1.5.5 使用酸性脲酶  24-25
  1.6 研究精氨酸代谢的意义  25-26
    1.6.1 分类学意义  25
    1.6.2 生物学意义  25
    1.6.3 对葡萄酒酿造的影响  25-26
  1.7 本研究的目的和意义  26-27
第二章材料与方法  27-31
  2.1 材料  27-28
    2.1.1 菌株  27
    2.1.2 培养基  27
      2.1.2.1 ATB 基本培养基  27
      2.1.2.2 模拟酒的配制  27
    2.1.3 主要试剂及来源  27
    2.1.4 主要仪器  27-28
  2.2 方法  28-31
    2.2.1 O.OENI 接种至模拟酒  28
    2.2.2 O.OENI 生长状况的测定方法  28
    2.2.3 精氨酸的测定方法  28
    2.2.4 瓜氨酸的测定方法  28
    2.2.5 鸟氨酸的测定方法  28-29
    2.2.6 潜在EC 的测定方法  29
    2.2.7 EC 含量的测定方法  29-31
      2.2.7.1 标准溶液的配制  29
      2.2.7.2 PC 内标溶液  29
      2.2.7.3 标准曲线的绘制  29-30
      2.2.7.4 模拟酒的萃取  30
      2.2.7.5 GC/MS 条件  30-31
第三章结果与分析  31-41
  3.1 模拟酒中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸的含量测定  31-34
    3.1.1 精氨酸标准曲线绘制  31
    3.1.2 瓜氨酸标准曲线绘制  31-32
    3.1.3 鸟氨酸标准曲线绘制  32
    3.1.4 SD-2A 菌株在ATB培养基中的生长状况  32-33
    3.1.5 接种SD-2A 菌种的模拟酒中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸的变化情况  33
    3.1.6 接种SD-2B，SD-1G 菌种的模拟酒中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸的变化情况  33-34
  3.2 模拟酒中EC 含量的测定  34-41
    3.2.1 校正标准曲线绘制及回收率测定  34
    3.2.2 模拟酒中EC 含量测定  34-41
第四章讨论  41-43
  4.1 O.OENI 在模拟酒中精氨酸代谢情况  41
  4.2 葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的检测  41-42
  4.3 模拟酒中EC 潜在浓度的测定  42-43
第五章结论与研究展望  43-44
  5.1 结论  43
  5.2 研究展望  43-44
参考文献  44-51
致谢  51-52
作者简介  52

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