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一种酸性脲酶的固定化研究

作　者: 吴召慧
导　师: 田亚平
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酸性脲酶发酵提取固定化酶黄酒尿素氨基甲酸乙酯
分类号: Q814.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

酸性脲酶可以在酒中分解尿素,将尿素分解为氨和二氧化碳,从而达到降低酒中致癌物质氨基甲酸乙酯的目的。本论文对本实验室的一株产酸性脲酶的菌种进行了发酵：在7L发酵罐中,菌体在前16h增长迅速,酶活在24h达到最大,为1.75U/mL。在25L发酵罐中的发酵情况为：菌体在前16h增长迅速,酶活在22h达到最大,为2.23U/mL细胞破碎效果比较：在实验室提取少量酶时,适宜采用超声波破碎；在大规模制备酶时,选择高压破碎进行细胞破碎更优。固定化酸性脲酶的最适海藻酸钠浓度、氯化钙浓度和壳聚糖浓度分别为2.0g/100mL、5.0g/100mL和0.3g/100mL,最适固定化时间为2.5h,戊二醛的合适浓度为0.1%,戊二醛的交联时间为3h,酶的总固定化率为82.3%。固定化酸性脲酶的最适反应温度为40℃、最适pH为4.0、半衰期为74天、固定化酸性脲酶在25～55℃之间,酶有较好的热稳定性,相对酶活在80%以上、pH稳定范围为3-6.5,游离酸性脲酶的最适反应温度为35℃、最适pH为5.5、半衰期为28天。固定化酸性脲酶可以重复使用13次,总的尿素去除率达到60%左右。由于渗透及空间位阻的影响,金属离子及有机酸对固定化酸性脲酶的影响作用没有对游离酸性脲酶的影响大。在黄酒酒精浓度范围内,酒精对固定化酶酶活影响不大。固定化酸性脲酶在连续使用过程中去除黄酒中尿素的效果：150g固定化酸性脲酶可以使4L黄酒中的尿素浓度从34.2mg/L降低至13.6mg/L,平均尿素去除率为60%。黄酒在固定化酸性脲酶中作用后,黄酒中主要的风味物质在含量上基本没有改变。氨基甲酸乙酯的含量有所降低。按0.05U/mL的添加量向黄酒中加入酸性脲酶的粗酶粉、液体酶、产酸性脲酶的细胞粉,因细胞粉在经过72h后仍然有部分未溶,相比较而言,液体酶和酶粉的尿素去除效果较好,它们在72小时内尿素去除率分别达到了63%和59%。将酸性脲酶分别按0.05U/mL、0.08U/mL和0.12U/mL的添加量加入未煎酒的8L新产黄酒中,在第一天,加酶量高的黄酒中,尿素含量稍低,在第三天时,不同加酶量的尿素去除效果相差不大。降低尿素之后,经85℃,30min煎酒处理,黄酒中EC的生成量明显减少。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章绪论  9-16
  1.1 研究背景  9-11
    1.1.1 氨基甲酸乙酯  9
    1.1.2 酸性脲酶  9-10
    1.1.3 酶的固定化  10-11
  1.2 研究进展  11-15
    1.2.1 氨基甲酸乙酯的研究进展  11-13
    1.2.2 酸性脲酶的研究进展  13-14
    1.2.3 固定化酶的研究进展  14-15
  1.3 研究意义  15
  1.4 本论文主要研究内容  15-16
第二章材料与方法  16-22
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 菌种  16
    2.1.2 主要试剂  16
    2.1.3 主要仪器  16-17
  2.2 实验方法  17-22
    2.2.1 酸性平板鉴别培养基  17
    2.2.2 中性平板鉴别培养基  17
    2.2.3 种子培养基  17
    2.2.4 发酵培养基  17-18
    2.2.5 实验试剂的配制  18
    2.2.6 菌种复壮  18
    2.2.7 全细胞制备  18
    2.2.8 超声破碎  18-19
    2.2.9 高压细胞破碎  19
    2.2.10 7L罐发酵条件  19-20
    2.2.11 25L罐发酵条件  20
    2.2.12 酸性脲酶的固定化方法  20
    2.2.13 固定化酸性脲酶半衰期的测定  20
    2.2.14 固定化酸性脲酶最适温度  20
    2.2.15 固定化酸性脲酶最适pH  20
    2.2.16 固定化酸性脲酶温度稳定性  20
    2.2.17 固定化酸性脲酶pH稳定性  20-21
    2.2.18 金属离子及有机酸对固定化酸性脲酶的影响  21
    2.2.19 乙醇对固定化酸性脲酶的影响  21
    2.2.20 尿素去除率的测定方法  21
    2.2.21 氨基甲酸乙酯的测定方法  21-22
第三章结果与讨论  22-37
  3.1 酸性脲酶的发酵优化及提取制备  22-24
    3.1.1 7L发酵罐的发酵情况  22
    3.1.2 25L发酵罐的发酵情况  22-24
    3.1.3 酸性脲酶的提取  24
  3.2 酸性脲酶固定化方法的筛选及条件优化  24-28
    3.2.1 海藻酸钠浓度对固定化酸性脲酶的影响  24-26
    3.2.2 CaCl_2浓度对固定化酸性脲酶酶活的影响  26
    3.2.3 壳聚糖浓度对固定化酸性脲酶酶活的影响  26
    3.2.4 时间对固定化酸性脲酶酶活的影响  26-27
    3.2.5 戊二醛浓度对固定化酸性脲酶酶活的影响  27
    3.2.6 交联时间对固定化酸性脲酶酶活的影响  27-28
  3.3 固定化酸性脲酶的基本性质及初步应用  28-35
    3.3.1 固定化酸性脲酶半衰期  28-29
    3.3.2 固定化酸性脲酶最适反应温度  29
    3.3.2 固定化酸性脲酶最适pH  29
    3.3.4 固定化酸性脲酶温度稳定性  29-30
    3.3.5 固定化酸性脲酶pH稳定性  30
    3.3.6 固定化酸性脲酶的重复使用性  30-31
    3.3.7 金属离子及有机酸对固定化酸性脲酶的影响  31-32
    3.3.8 乙醇对固定化酸性脲酶的影响  32
    3.3.9 固定化酸性脲酶去除黄酒中的尿素  32-35
  3.4 酸性脲酶在黄酒中的规模化应用之可行性研究  35-37
    3.4.1 不同状态的酸性脲酶去除黄酒中的尿素  35-36
    3.4.2 不同添加量的酸性脲酶去除黄酒中的尿素  36
    3.4.3 降低尿素后黄酒中EC的变化  36-37
结论与展望  37-39
  1 主要结论  37-38
  2 展望  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-45
攻读硕士学位期间发表的论文  45
专利申请  45-46
附录  46

一种酸性脲酶的固定化研究

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