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鲈鱼电压门控型钾离子通道spKv1.3的克隆及功能特征研究

作　者: 王永杰
导　师: 黄晓航
学　校: 国家海洋局第一海洋研究所
专　业: 海洋生物学
关键词: spKv1.3 鲈鱼 4-氨基吡啶 中国仓鼠卵巢细胞 全细胞模式 膜片钳
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


电压门控型钾离子通道在兴奋性和非兴奋性细胞的细胞膜上都起着重要的作用。当前研究的热点之一是淋巴细胞中Kv1.3通道，Kv1.3在淋巴细胞中参与多种细胞功能，如细胞增殖、细胞体积调节等。Kv1.3在细胞的非特异性免疫应答过程中也起着重要的功能调节作用，它能启动和控制白介素IL和肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子在细胞内的合成。目前，对Kv1.3在鱼类中的作用机理却鲜有报道。对离子通道的研究主要是采用膜片钳技术，由于细胞中含有多种离子通道，缺乏特定通道的特异性药物，利用该技术就很难对其进行系统的研究，而且膜片钳技术很难深入到分子水平去阐明离子通道的分子结构与作用机理。本文将现代分子生物学技术与膜片钳技术结合起来，以海洋经济鱼类鲈鱼为模板，对鲈鱼中的电压门控型钾离子通道Kv1.3进行了研究。通过已知的其他物种的Kv1.3基因，设计了一对特异性引物，通过PCR从鲈鱼血液的淋巴细胞cDNA中扩增到了一条629bp的序列，经过RACE技术获得了鲈鱼此基因的全长共2152bp，其中开放阅读框1440bp，编码480个氨基酸，其预测分子量和等电点分别为60.8kDa和9.22，将此基因命名为spKv1.3。通过构建系统进化树发现spKv1.3属于Kv1.3分支。通过对spKv1.3和其他物种的同类基因进行比对发现，spKv1.3与同为硬骨鱼类的罗非鱼的Kv1.3同源性达到95%；疏水性预测发现它有6个明显的疏水区和一个中心区；跨膜结构域预测结果显示spKv1.3有6个典型的跨膜区和一个中心区；同时还发现，在鲈鱼组织如鳃、肌肉、头肾、脑、脾脏、肠、肝脏、皮肤和血液中都能检测到spKv1.3mRNA的存在，而在脑组织中的表达量远远高于其他组织。这说明spKv1.3是一个组成型的基因，广泛分布并参与各个组织的生理功能；通过基因组DNA分析发现鲈鱼的spKv1.3只有外显子，并不含有内含子。为研究钾离子通道Kv1.3在鲈鱼非特异性免疫应答机制中的作用，通过实时定量PCR，我们发现当以5μg/mL的LPS刺激时，淋巴细胞中的spKv1.3通道基因和细胞因子基因IL-β和TNF-α mRNA都能被LPS诱导。在LPS刺激2h时，IL-β和TNF-α mRNA的表达量分别是对照组的2.46倍和3.36倍；在LPS刺激4h时，spKv1.3mRNA的表达量是对照组的2.98倍；在同时使用LPS和钾通道特异性阻断剂4-AP时，spKv1.3、IL-β和TNF-α mRNA的表达量也都能上升，在刺激4h时，三者的mRNA表达量分别是对照的2.17倍、20.82倍和16.44倍；且持续时间更长，达到12h时，三者的表达量仍然是对照组的2.75倍、7.16倍和13.36倍。研究结果显示，尽管4-AP能够阻断钾离子通道的生理功能，但在转录水平上上述三种基因的表达都能得到大幅提升，表明淋巴细胞上的钾通道蛋白被阻断后，细胞可能启动了另一种信号通路或作用机制，将钾通道被阻断的信息反馈，进而使细胞启动spKv1.3、IL-β和TNF-α mRNA的转录。鉴于淋巴细胞存在多种不同类型的钾离子通道，通过全细胞模式膜片钳技术尚无法实现对Kv1.3通道的电生理学研究。实验中我们发现，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)自身含有极少的钾离子通道，是研究体外表达钾离子通道特性的理想工具；通过转染技术使鲈鱼spKv1.3在CHO细胞系中高效表达，呈现出典型的快速激活外向整流型钾电流，其激活电压是-20mV，在+70mV时的电流达到2057.5±590.85pA；加入终浓度为5mM的阻断剂4-AP后，spKv1.3的激活电压并没改变；但4-AP能使spKv1.3通道的电流发生衰减，降低了电流的振幅最大值，在70mV时的电流降到777.19±291.35pA，阻断率是62.2±23.07%；4-AP的阻断呈现出一种强烈的电压依赖性，在通道被激活后，随着电压的增高，阻断率从-10mV时的23.4±12.77%到了+70mV时的62.2±23.07%，两者具有明显的差异(P<0.05)。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-12
第一章 前言  12-33
  1.1 离子通道概述  12-13
  1.2 离子通道的分类  13-14
    1.2.1 非门控型离子通道  13
    1.2.2 电压门控型离子通道(voltage-gated ion channels)  13-14
    1.2.3 化学门控型离子通道(chemically-gated ion channels)  14
    1.2.4 机械门控型离子通道(mechanically-gated ion channels)  14
  1.3 钾离子通道简介  14-23
    1.3.1 钾离子通道的结构特点  15-19
    1.3.2 淋巴细胞中的钾离子通道  19-22
    1.3.3 鱼类中钾离子通道的研究进展  22-23
  1.4 膜片钳技术(patch clamp technique)与离子通道的研究  23-26
    1.4.1 膜片钳技术及其工作原理  23-24
    1.4.2 膜片钳技术的常用记录模式  24-25
    1.4.3 膜片钳技术在生物学上的应用  25-26
  1.5 本研究的目的及意义  26-27
  参考文献  27-33
第二章 鲈鱼 spKv1.3 基因的克隆及序列分析  33-53
  2.1 材料与方法  33-41
    2.1.1 实验材料  33
    2.1.2 实验试剂和仪器  33-34
    2.1.3 spKv1.3 基因 PCR 引物的设计  34
    2.1.4 提取鲈鱼血液总 RNA  34-35
    2.1.5 逆转录合成第一条 cDNA 链  35
    2.1.6 PCR 扩增鲈鱼 spKv1.3 基因的 cDNA 核心序列  35
    2.1.7 回收 PCR 扩增片段  35
    2.1.8 回收片段与载体连接并转化感受态细胞  35-36
    2.1.9 重组子的鉴定  36
    2.1.10 测序结果验证  36
    2.1.11 鲈鱼 spKv1.3 基因的 5’RACE  36-37
    2.1.12 鲈鱼 spKv1.3 基因的 3’RACE  37-38
    2.1.13 鲈鱼 spKv1.3 基因的测序结果拼接  38-39
    2.1.14 鲈鱼 spKv1.3 基因序列的生物信息学分析  39
    2.1.15 鲈鱼 spKv1.3 基因在基因组中的组成分析  39-41
  2.2 实验结果  41-48
    2.2.1 设计特异性 PCR 引物  41
    2.2.2 总 RNA 的提取  41
    2.2.3 扩增获取鲈鱼 spKv1.3 基因的核心序列  41
    2.2.4 5’RACE 扩增鲈鱼 spKv1.3 基因的 5’端  41
    2.2.5 3’RACE 扩增鲈鱼 spKv1.3 基因的 3’端  41-42
    2.2.6 拼接获取鲈鱼 spKv1.3 基因的全长序列  42-43
    2.2.7 鲈鱼 spKv1.3 基因序列的生物信息学分析  43-47
    2.2.8 鲈鱼 spKv1.3 基因在基因组中的组成分析  47-48
  2.3 讨论  48-51
  参考文献  51-53
第三章 spKv1.3 基因及免疫细胞因子的表达调控分析  53-70
  3.1 材料与方法  53-56
    3.1.1 实验材料  53
    3.1.2 实验试剂和仪器  53-54
    3.1.3 Real-Time PCR 引物的设计  54
    3.1.4 鲈鱼样本的处理及总 RNA 的提取  54-55
    3.1.5 PCR 反应预实验  55
    3.1.6 Real-time PCR 反应条件及反应体系的优化  55
    3.1.7 重复性和特异性实验  55-56
    3.1.8 扩增效率比对实验  56
    3.1.9 实验数据的输出与分析  56
  3.2 实验结果  56-63
    3.2.1 Real-time PCR 引物设计结果  56
    3.2.2 PCR 反应预实验结果  56
    3.2.3 重复性和特异性实验  56-58
    3.2.4 扩增效率比对  58-59
    3.2.5 Real-time PCR 结果处理  59-63
  3.3 讨论  63-67
  参考文献  67-70
第四章 spKv1.3 的电生理学特性  70-88
  4.1 材料与方法  70-76
    4.1.1 实验材料  70
    4.1.2 实验试剂和仪器  70-72
    4.1.3 spKv1.3 全长的引物的设计  72
    4.1.4 提取鲈鱼血液总 RNA  72
    4.1.5 逆转录合成第一条 cDNA 链  72-73
    4.1.6 PCR 扩增鲈鱼 spKv1.3 基因的全长序列  73
    4.1.7 回收 PCR 扩增片段  73
    4.1.8 回收的 PCR 片段进行加 A 反应  73
    4.1.9 回收片段与载体连接并转化感受态细胞  73-74
    4.1.10 重组子的鉴定  74
    4.1.11 构建重组表达载体 pcDNA3.1-spKv1.3  74-75
    4.1.12 重组表达载体 pcDNA3.1-spKv1.3 转染 CHO 细胞  75
    4.1.13 膜片钳实验  75-76
    4.1.14 数据采集和处理  76
    4.1.15 统计学分析  76
  4.2 实验结果  76-81
    4.2.1 spKv1.3 全长引物的设计结果  76-77
    4.2.2 spKv1.3 全长的获取结果  77
    4.2.3 spKv1.3 与 T-载体连接结果  77-78
    4.2.4 spKv1.3 与 pcDNA3.1 连接结果  78
    4.2.5 pcDNA3.1-spKv1.3 与 pEGFP-N2 共转染 CHO 结果  78
    4.2.6 膜片钳实验结果  78-81
  4.3 讨论  81-85
  参考文献  85-88
第五章 实验总结与展望  88-92
  5.1 实验总结  88-90
  5.2 展望  90-92
硕士期间发表论文  92-93
致谢  93

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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物细胞学
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