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抗心肌Na~+/Ca~(2+)交换体α-1_(138-177)和α-2_(840-877)多克隆抗体的制备及其功能研究

作　者: 李明华
导　师: 封启龙
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: Na+/Ca2+交换体 多克隆抗体 膜片钳技术 离子通道
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:在制备抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）两种多克隆抗体的基础上,分别观察它们对大鼠心肌细胞Na+/Ca2+交换体、L型钙通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道电流的影响。方法:1.抗体制备和纯化:用化学合成的Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）短肽对新西兰大耳白兔进行主动免疫获取抗血清,间接ELISA法检测免疫后抗血清效价,用Protein A层析柱对抗体进行亲和纯化。2.膜片钳全细胞记录:应用膜片钳全细胞记录模式观察抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）两种多克隆抗体分别对心肌细胞Na+/Ca2+交换电流、L型钙电流、瞬时外向钾电流和内向整流钾电流的影响。3.采用EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms软件对Na+/Ca2+交换体α-l（138-177）、α-2（840-877）短肽序列分别与L型钙通道孔环的氨基酸序列进行了比对。结果:1.抗体效价、浓度及纯化结果:间接ELISA法检测结果表明,在第三次加强免疫后,抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）抗血清效价均高达1:243000。抗血清经Protein A纯化后发现,抗α-1（138-177）和α-2（840-877）抗体浓度分别为13.1mg/ml和7.21mg/ml。SDS-PAGE检测显示,纯化后的两种抗体在电泳时分别出现清晰的2条带,其分子量分别为25和50 kD左右（图1.1,1.2）。2.抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）两种多克隆抗体对成年大鼠心肌细胞Na+/Ca2+交换电流及其他离子通道电流的影响:膜片钳全细胞记录结果表明,在1-104 nmol/L浓度范围内,抗α-1（138-177）和抗α-2（840-877）两种多克隆抗体对大鼠心肌细胞外向和内向Na+/Ca2+交换电流均表现出剂量依赖性的抑制作用（表2.1、2.2,图2.1、2.2）。对两种多克隆抗体作用选择性的研究发现,102-104 nmol/L的抗α-1抗体, 104nmol/L的抗α-2抗体对L型钙电流也具有抑制作用（表2.3、2.4,图2.3、2.4）。两种抗体在1-104 nmol/L浓度范围内对瞬时外向钾电流和内向整流钾电流均无明显作用（图2.5、2.6、2.7、2.8）。3. Na+/Ca2+交换体α-l（138-177）、α-2（840-877）短肽序列分别与L型钙通道氨基酸序列的相似性比较:氨基酸序列比对表明,Na+/Ca2+交换体α-l（138-177）重复序列与L型钙通道第4结构域孔环（1442-1483位氨基酸）序列的相似度为27.7%;Na+/Ca2+交换α-2（840-877）短肽序列与L型钙通道第2结构域孔环（697-730位氨基酸）序列的相似度为23.7% （图2.9）。结论:1.本研究采用主动免疫和亲和纯化的方法,制备并获得了高浓度和高纯度的抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）两种多克隆抗体,为对其进行进一步的功能研究奠定了基础。2.在低浓度（抗α-1抗体浓度≤10nmol/L,抗α-2抗体浓度≤103nmol/L）条件下,抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）抗体均可特异性地抑制大鼠心肌Na+/Ca2+交换体。3.在高浓度（102-104 nmol/L的抗α-1抗体,抗α-2抗体浓度104nmol/L）时,抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）抗体对大鼠心肌细胞L型钙通道具有交叉反应,亦表现出抑制作用。4.在1-104 nmol/L浓度范围内,抗心肌Na+/Ca2+交换体α-1（138-177）和α-2（840-877）抗体对大鼠心肌细胞瞬时外向钾电流和内向整流钾电流均无明显影响。

全文目录


中文摘要  5-7
English Abstract  7-10
缩略词表  10-11
前言  11-12
第一部分 抗心肌Na~+/Ca~(2+) 交换体α-1_(（138-177）)和α-2_(（840-877）)多克隆抗体的制备和纯化  12-16
  材料与方法  12-13
  结果  13-14
  讨论  14-16
第二部分 抗心肌Na~+/Ca~(2+) 交换体α-1_(（138-177）)和α-2_(（840-877）)多克隆抗体的功能研究  16-29
  材料与方法  16-18
  结果  18-26
  讨论  26-27
  结论  27-29
参考文献  29-32
综述  32-39
  参考文献  36-39
个人简介  39-40
致谢  40

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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