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对IVM影响大鼠P2X4离子通道失活效应的研究

作　者: 俞恰恰
导　师: 李志远
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ATP IVM P2X4 受体 ATP结合胞外区膜片钳失活时间τoff
分类号: Q25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

P2X受体家族是一类细胞膜上以胞外ATP(Adenosine Triphosphate)为配体的非选择性阳离子通道。P2X受体广泛分布于人体的各个组织器官中,因此参与人体多种重要的生理活动,如炎症反应、神经递质的释放以及神经性疼痛等。伊维菌素IVM(Ivermectin)是一种大环内脂类分子,可特异增大P2X家族P2X4离子通道电流并显著延长通道失活时间τoff (Deactivation time),但对P2X家族其它类型通道没有影响。Khakh等人研究表明不同浓度IVM对P2X4离子通道的作用不尽相同:高浓度与低浓度IVM都可显著增大P2X4通道电流,但高浓度IVM可明显增强ATP与受体结合,延长P2X4离子通道在撤去ATP后的τoff值,而低浓度IVM没有这种作用。Silberberg的研究认为IVM与受体的结合是一种别构作用;IVM与通道的结合部位是位于亚基TMs(Transmembrane domains)之间的疏水间隙;IVM与ATP结合P2X4通道的部位不重叠。基于前人的研究,本课题提出以下假设:1,给予低浓度IVM时, P2X4通道结合一个IVM分子,而应用高浓度IVM时, P2X4受体结合2～3个IVM分子,两个IVM共同作用稳定ATP与受体的结合;2,高浓度IVM间接稳定ATP与受体结合,推测靠近TMs的胞外区是高浓度IVM效应的响应部位;3,该部位上侧链较大的苯丙氨酸可能是高浓度IVM作用的响应位点。本课题目的在于鉴定靠近跨膜区的胞外区中影响高浓度IVM稳定大鼠P2X4离子通道与ATP结合的苯丙氨酸。HEK293T为ratP2X4蛋白表达载体;利用反向PCR技术向ratP2X4 WT中引入丙氨酸点突变并通过膜片钳全细胞记录模式记录电生理数据。课题选取ratP2X4受体上200、319以及330位苯丙氨酸作为丙氨酸点突变位点。实验结果表明:突变体均可形成功能性离子通道;与WT相比,F319A在高浓度IVM作用时的τoff基本不变,F200A的τoff明显降低,而F330A的τοff则有所增加;突变没有改变ATP对ratP2X4Rs的效能;IVM与F330A的结合能力有所加强。因此得出结论:F200是通道胞外区对高浓度IVM效应的一个响应位点;F330位点影响IVM与受体通道的结合,可进一步验证该位点是否会影响高浓度IVM的效应。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
引言  9-12
第1章研究背景  12-32
  1.1 P2X 离子通道家族受体简介  12-16
    1.1.1 P2X 受体编码基因的染色体定位  12
    1.1.2 P2X 受体亚基  12-13
    1.1.3 P2X 受体离子通道的开放与电生理特性  13-16
    1.1.4 P2X 受体的体内分布  16
  1.2 P2X4 离子通道受体  16-21
    1.2.1 ZebrafishP2X4 离子通道的晶体结构  16-18
    1.2.2 P2X4 的序列  18-19
    1.2.3 P2X4 离子通道受体的特性  19-21
    1.2.4 P2X4 通道在人体中的分布及其生理功能  21
  1.3 IVM 对 P2X4 受体通道的调节  21-25
    1.3.1 IVM 简介  21-22
    1.3.2 IVM 对P2X4 受体通道的影响  22-25
  1.4 膜片钳技术（Patch Clamp）  25-29
    1.4.1 电压钳和电流钳  25-26
    1.4.2 膜片钳技术实验原理  26-28
    1.4.3 膜片钳应用与展望  28-29
  1.5 课题创新及研究意义  29-32
    1.5.1 课题创新  29-31
    1.5.2 课题研究意义  31-32
第2章实验材料与实验方法  32-45
  2.1 实验材料  32-34
    2.1.1 细胞  32
    2.1.2 实验仪器  32-33
    2.1.3 实验试剂药品  33-34
  2.2 实验方法  34-45
    2.2.1 HEK293T 细胞的培养  34-36
    2.2.2 P2X4 WT 单位点突变体的制作  36-40
    2.2.3 膜片钳实验技术  40-45
第3章实验结果与讨论  45-55
  3.1 实验结果  45-51
    3.1.1 P2X4 受体通道氨基酸序列比对  45-46
    3.1.2 3μM IVM 作用下ratP2X4 离子通道的失活时间τoff  46-48
    3.1.3 ratP2X4 WT 与突变体的EC50  48-49
    3.1.4 ratP2X4 WT 与突变体10μM ATP 刺激2 秒后通道失活时间τoff  49-50
    3.1.5 ratP2X4 离子通道电流比C 值  50-51
  3.2 讨论  51-55
    3.2.1 实验分析与结论  51-53
    3.2.2 后续实验与展望  53-55
附录  55-56
参考文献  56-60
致谢  60

对IVM影响大鼠P2X4离子通道失活效应的研究

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