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丹波黑大豆bHLH30转录因子功能研究

作　者: 钱绍方
导　师: 李昆志
学　校: 昆明理工大学
专　业: 植物学
关键词: 铝毒黑大豆丹波 bHLH30转录因子转基因烟草
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

酸性土壤成分复杂,植物在酸性土壤中生长受到铝毒、低磷、酸害等多种因子的胁迫,其中铝是酸性土壤中限制作物生长的主要因素,其形态随着外界环境的改变而变化。当pH<5时,铝以A13+的形态存在,对植物根系造成危害,影响植物对水分和养分的吸收。虽然对植物的耐铝机制进行了很多研究,但是由于其复杂的物理化学性质,难以进行定位,因而对植物的耐铝机制的认识还很有限,仍处于推理假设阶段,所以还需要在实验中进行更进一步的验证。本研究室在研究丹波黑大豆铝处理SSH cDNA文库中发现bHLH30基因呈上调表达,推测该基因与丹波黑大豆的耐铝性相关。现有的研究表明bHLH转录因子与植物抗逆性、次生代谢、生长发育和形态建成密切相关。但是到目前为止,还没有大豆bHLH转录因子功能的研究。本研究以耐铝能力较强的大豆栽培种丹波黑大豆为材料,分离bHLH30基因,通过构建植物表达载体并转化野生型烟草,鉴定其功能,为研究丹波黑大豆耐铝作用机理奠定了一定的理论基础。主要研究结果如下：运用半定量RT-PCR技术分析了50μM AlCl3处理不同时间的丹波黑大豆和云南小黑豆bHLH30的表达情况,结果表明两种黑豆根中bHLH30的表达量随着50μM AICI3处理时间的增加而增加；其表达量呈先上升后下降的趋势,说明丹波黑大豆bHLH30基因的表达受铝胁迫的诱导。通过克隆50μM A1C13处理8h丹波黑大豆根的bHLH30基因,构建pMD18T-GmbHLH30载体,对其ORF翻译得到的氨基酸序列进行蛋白质同源性搜索,构建bHLH30系统进化树。系统发育分析结果表明bHLH25、bHLH30、bHLH51、bHLH106的系统进化相对独立,bHLH30与bHLH51、bHLH106两类转录因子亲缘关系相对较近,而与bHLH25亲缘关系则相对较远。结构域分析显示GmbHLH30含有碱性区域、HLH区域,说明GmbHLH30蛋白可以结合DNA序列。构建原核表达载体pE728a(+)-GmbHLH30,序列分析发现GmbHLH30基因含有多个稀有密码子,因此导入E. coli Rosetta (DE3)中进行原核蛋白的表达,对表达的重组蛋白进行纯化。GmbHLH30重组蛋白完全以包涵体形式存在,采取割胶纯化的方法,纯化得到的目的蛋白,作为抗原用于抗体的制备。构建植物表达载体pK2-35S-GmbHLH30,转染烟草,在基因组水平、转录水平以及蛋白质表达水平对转基因烟草进行检测,筛选得到阳性表达植株GmbHLH30-10和GmbHLH30-20两个株系。转GmbHLH30基因烟草耐铝生理特性分析结果表明：50μMAICl3胁迫处理24h后,转基因的两个株系GmbHLH30-10和GmbHLH30-20的相对根伸长分别是野生型烟草的2倍和1.75倍；转基因株系根中可溶性糖含量上升,Pro、MDA、H202和PC含量下降,说明铝胁迫下转GmbHLH30基因烟草可以通过维持植物体内渗透压的稳态、较低的膜脂过氧化水平以减少氧化损伤来抵御铝胁迫,从而提高转GmbHLH30基因烟草的耐铝能力。综上所述,丹波黑大豆根中bHLH30基因受铝诱导且呈上调表达,其基因结构含有碱性区域、HLH区域,GmbHLH30蛋白能与DNA序列结合,并调控下游基因表达。转GmbHLJ30基因烟草具有耐铝生理特性,表明GmbHLH30基因具有耐铝功能。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
插图和附表清单  12-14
縮略词  14-16
第一章绪言  16-36
  1.1 酸性土壤的分布及铝的存在形态  16
  1.2 铝对植物的毒害  16-17
  1.3 植物耐铝毒的生理机制  17-19
    1.3.1 外部排斥机制  17-19
      1.3.1.1 有机酸的分泌  17-18
      1.3.1.2 根系其它分泌物的作用  18
      1.3.1.3 根际pH的升高  18-19
      1.3.1.4 细胞壁对铝的固定  19
    1.3.2 内部耐受机制  19
  1.4 植物耐铝毒的分子机制  19-23
    1.4.1 植物耐铝基因的分离与鉴定  20
    1.4.2 提高植物耐铝能力基因工程  20-23
      1.4.2.1 过量表达有机酸代谢相关酶  22
      1.4.2.2 过量表达有机酸通道蛋白  22-23
      1.4.2.3 过量表达抗氧化酶或其他铝胁迫响应基因  23
  1.5 大豆耐铝毒机制  23-27
    1.5.1 大豆耐铝毒的生理机制  23-24
    1.5.2 大豆耐铝毒的分子机制  24-27
      1.5.2.1 转运蛋白相关基因  25
      1.5.2.2 信号转导相关基因  25-26
      1.5.2.3 其它胁迫相关基因  26-27
  1.6 转录因子  27-29
    1.6.1 转录因子的结构特点  27
    1.6.2 转录因子的功能特点  27-28
    1.6.3 转录因子在植物抗逆性调控中的作用  28-29
  1.7 bHLH转录因子  29-34
    1.7.1 bHLH转录因子的结构特点  29-30
    1.7.2 bHLH转录因子的分类  30-31
    1.7.3 bHLH转录因子的生物学功能及作用机理  31-34
      1.7.3.1 参与植物生长发育和形态建成的调控  31-32
      1.7.3.2 参与植物次生代谢的调控  32-33
      1.7.3.3 参与植物的抗逆性的调控  33-34
  1.8 本研究的目的和意义  34-36
第二章材料与方法  36-56
  2.1 材料和方法  36-40
    2.1.1 植物材料  36
    2.1.2 菌株及质粒  36-37
    2.1.3 主要试剂  37
    2.1.4 主要仪器  37-38
    2.1.5 培养基和抗生素  38-40
  2.2 实验方法  40-56
    2.2.1 植物材料培养  40-41
    2.2.2 引物合成  41
    2.2.3 植物总RNA提取  41-42
    2.2.4 植物总RNA纯化  42
    2.2.5 第一链cDNA合成  42
    2.2.6 PCR扩增GmbHLH30基因  42-43
    2.2.7 DNA片段回收  43-44
    2.2.8 PCR产物的TA克隆  44
    2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  44-45
    2.2.10 质粒提取  45
    2.2.11 质粒酶切检测  45-46
    2.2.12 DNA片段的连接  46
    2.2.13 原核表达载体的构建  46
    2.2.14 总蛋白的定量  46-47
    2.2.15 SDS-PAGE操作程序  47-48
    2.2.16 蛋白表达条件的优化  48
    2.2.17 蛋白His-Trap HP柱纯化方法  48-49
    2.2.18 包涵体蛋白的割胶纯化  49-50
    2.2.19 入门克隆载体pENTR2B-GmbHLH30的构建  50
    2.2.20 Gateway LR反应  50
    2.2.21 电击转化感受态农杆菌  50-51
    2.2.22 菌落PCR鉴定阳性农杆菌  51
    2.2.23 农杆菌侵染法转化烟草  51-52
    2.2.24 CTAB法提取烟草基因组  52
    2.2.25 植物总蛋白提取  52
    2.2.26 Western Blotting  52-53
    2.2.27 烟草植株相对根伸长测定  53-54
    2.2.28 烟草植株中可溶性糖含量测定  54
    2.2.29 烟草植株中脯氨酸(Pro)含量测定  54
    2.2.30 烟草植株中丙二醛(MDA)含量测定  54-55
    2.2.31 烟草植株中过氧化氢(H_2O_2)含量测定  55
    2.2.32 烟草植株中蛋白质羰基(PC)含量测定  55
    2.2.33 数据统计分析  55-56
第三章实验结果  56-77
  3.1 不同黑豆根中bHLH30基因表达谱分析  56
  3.2 GmbHLH30基因的扩增、TA克隆  56-65
    3.2.1 GmbHLH30基因的克隆  56-58
    3.2.2 pMD18T-GmbHLH30测序结果生物信息学分析  58-65
      3.2.2.1 测序得到的GmbHLH30序列拼接、ORF分析  58-59
      3.2.2.2 GmbHLH30同源性搜索、系统进化树分析  59-61
      3.2.2.3 GmbHLH30转录因子结构域分析  61-65
  3.3 原核表达载体构建与重组蛋白的表达纯化  65-70
    3.3.1 原核表达载体pET28a(+)-GmbHLH30的构建  65-67
    3.3.2 pET28a(+)-GmbHLH30测序结果分析  67-68
    3.3.3 GmbHLH30重组蛋白的表达纯化  68-70
    3.3.4 GmbHLH30抗体效价评价  70
  3.4 植物表达载体构建与烟草遗传转化  70-73
    3.4.1 入门载体pENTR2B-GmbHLH30的构建  70-72
    3.4.2 pENTR2B-GmbHLH30测序结果分析  72
    3.4.3 植物表达载体pK2-35S-GmbHLH30的构建与烟草遗传转化  72-73
  3.5 转GmbHLH30基因烟草分子生物学检测  73-75
    3.5.1 转GmbHLH30基因烟草基因组水平检测  73
    3.5.2 转GmbHLH30基因烟草转录水平检测  73
    3.5.3 转GmbHLH30基因烟草蛋白质水平检测  73-75
  3.6 转GmbHLH30基因烟草生理特性分析  75-77
    3.6.1 铝胁迫对转GmbHLH30基因烟草相对根伸长的影响  75
    3.6.2 铝胁迫对转GmbHLH30基因烟草可溶性糖、脯氨酸含量的影响  75
    3.6.3 铝胁迫对转GmbHLH30基因烟草膜脂过氧化水平的影响  75-77
第四章讨论  77-79
第五章总结及展望  79-82
  5.1 总结  79-81
  5.2 展望  81-82
致谢  82-83
参考文献  83-94
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  94

丹波黑大豆bHLH30转录因子功能研究

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