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云南蚕豆叶片铝胁迫响应基因的筛选与表达分析

作　者: 王康
导　师: 李昆志
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蚕豆铝毒 SSH文库表达谱
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

铝毒是酸性土壤中植物生长受限制的主要因素,我国是拥有大面积以红壤为主的酸性富铝化土壤的农业大国,对植物耐铝毒机制的研究就显得非常重要。蚕豆营养丰富,是豆类作物中仅次于大豆的一种植物蛋白资源,也是重要的粮食、蔬菜、副食、绿肥作物。中国是世界上蚕豆栽培面积最大的国家,云南是中国蚕豆栽培面积最大的省份。近年来,云南蚕豆的种植面积迅速增加,但酸性土壤严重影响到蚕豆生长和蚕豆的产量。因此,研究探讨铝毒对蚕豆的影响及其解铝毒途径,对于揭示植物抗铝毒机制具有重要的理论和实践意义。本实验室的前期实验证实云南蚕豆品种83324是铝耐受品种,在此基础上,本研究对云南蚕豆品种83324耐铝毒机理进行探究。主要的研究结果如下：1、以水培的蚕豆为材料,研究了铝胁迫处理不同时间对蚕豆叶片生理生化指标的影响。结果表明,随着铝处理时间的延长,蚕豆叶片的丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)含量和蛋白质羰基(PC)含量增加,并呈现先上升后下降又上升的趋势。铝胁迫下蚕豆叶片的总蛋白含量与对照相比降低,呈现先上升后下降的趋势；可溶性糖含量也呈现先上升后下降的趋势。另外,随着铝胁迫时间的增加,蚕豆叶片气孔导度降低,气孔长度与宽度的比值与对照相比均增大。2、以50μM、100μM的AICl3溶液处理不同时间后的蚕豆叶片为检验方,以未处理的材料为削减方,构建了云南蚕豆品种83324叶片的正向抑制差减(SSH) cDNA文库,对测序结果进行序列比对,结果获得222条EST,其中有功能的EST 198条,未知功能的24条。将有功能的EST分为8类,其中代谢、光合作用以及蛋白质合成、信号转导及转录相关基因各52、36、28、25条,分别占功能已知EST的26%、18%、14%、13%；防御胁迫与细胞凋亡、转运、能量代谢,细胞结构与生长相关基因各20、12、10、7条,分别占功能已知EST的10%、6%、5%和4%。3、通过RT-PCR对文库基因表达的情况进行分析,结果表明,随机挑选的包括捕光叶绿体a/b蛋白复合体、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、ABC1家族蛋白、过氧化物酶、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶、景天庚酮糖1,7-二磷酸酯酶、转酮醇酶等基因在50μM和100μM Al胁迫处理后其表达均上调,进一步说明该文库的可靠性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
插图和附表清单  11-12
缩略词  12-14
第一章前言  14-32
  1.1 铝在土壤中的存在形态  14
  1.2 酸性土壤的特性和现状  14-16
  1.3 铝对植物的毒害  16-18
  1.4 植物的耐铝机理  18-29
    1.4.1 植物耐铝的生理学机理  18-24
    1.4.2 植物耐铝的分子机理  24-29
  1.5 蚕豆生产现状及蚕豆耐铝机制研究进展  29-30
  1.6 本研究的目的与意义  30-32
第二章材料与方法  32-45
  2.1 植物材料及培养方法  32
  2.2 蚕豆叶片的生理学实验  32-34
    2.2.1 样品的铝胁迫处理及叶片的收集  32
    2.2.2 铝胁迫下蚕豆叶片丙二醛含量的测定  32
    2.2.3 铝胁迫下蚕豆叶片过氧化氢含量的测定  32-33
    2.2.4 铝胁迫下蚕豆叶片蛋白质羰基含量的测定  33
    2.2.5 铝胁迫下蚕豆叶片总蛋白含量的测定  33
    2.2.6 铝胁迫下蚕豆叶片可溶性糖含量的测定  33-34
    2.2.7 铝胁迫下蚕豆叶片气孔开度的观测  34
  2.3 Al胁迫下蚕豆叶片SSH文库的构建  34-42
    2.3.1 样品的铝胁迫处理及叶片的收集  34
    2.3.2 总RNA提取与纯化  34-35
    2.3.3 mRNA的分离  35-36
    2.3.4 cDNA第一链的合成  36
    2.3.5 cDNA第二链的合成  36-37
    2.3.6 RSaI酶消化  37
    2.3.7 Tester cDNA与接头连接  37-38
    2.3.8 抑制性差减杂交  38
    2.3.9 PCR扩增  38-39
    2.3.10 大量PCR及PCR产物回收  39-40
    2.3.11 PCR产物与载体连接  40
    2.3.12 连接产物转化  40-41
    2.3.13 菌液PCR筛选  41
    2.3.14 序列测定及生物信息学分析  41-42
  2.4 基因表达谱分析  42-45
    2.4.1 样品的铝胁迫处理及叶片的收集  42
    2.4.2 引物设计  42-43
    2.4.3 RNA的提取与纯化  43
    2.4.4 cDNA第一链的合成  43-44
    2.4.5 RT-PCR  44-45
第三章结果与分析  45-68
  3.1 铝胁迫对蚕豆叶片生理生化指标的影响  45-48
    3.1.1 铝胁迫对蚕豆叶片丙二醛和H_2O_2含量的影响  45
    3.1.2 铝胁迫对蚕豆叶片PC含量的影响  45-46
    3.1.3 铝胁迫对蚕豆叶片总蛋白和可溶性糖含量的影响  46-47
    3.1.4 铝胁迫对蚕豆叶片气孔导度的影响  47-48
  3.2 蚕豆叶片在铝胁迫下正向SSH cDNA文库的构建  48-65
    3.2.1 蚕豆品种83324叶片总RNA的提取与质量分析  48-49
    3.2.2 mRNA的分离  49
    3.2.3 双链cDNA合成与RsaI的酶切  49-50
    3.2.4 Tester cDNA与接头连接、消减杂交和抑制PCR  50
    3.2.5 大量PCR产物回收  50-51
    3.2.6 连接与转化  51
    3.2.7 SSH cDNA文库筛选  51
    3.2.8 SSH cDNA文库克隆的序列分析及基因功能聚类  51-65
  3.3 基因表达谱分析  65-68
    3.3.1 50μM的Al胁迫处理时间梯度表达谱  65-66
    3.3.2 100gM的Al胁迫处理时间梯度表达谱  66-68
第四章讨论  68-79
  4.1 铝胁迫对蚕豆叶片生理生化指标的影响  68-71
    4.1.1 铝胁迫对蚕豆叶片丙二醛和H_2O_2含量的影响  68-69
    4.1.2 铝胁迫对蚕豆叶片PC含量的影响  69
    4.1.3 铝胁迫对蚕豆叶片总蛋白含量和可溶性糖含量的影响  69-70
    4.1.4 铝胁迫对蚕豆叶片气孔导度的影响  70-71
  4.2 蚕豆铝胁迫响应相关基因  71-79
    4.2.1 代谢和能量相关基因  71-73
    4.2.2 光合作用相关基因  73-74
    4.2.3 信号转导及转录相关基因  74-76
    4.2.4 防御胁迫与细胞凋亡相关基因  76-78
    4.2.5 转运相关基因  78-79
第五章总结与展望  79-81
  5.1 铝胁迫对云南蚕豆品种83324生理生化指标的影响  79
  5.2 云南蚕豆品种83324铝胁迫下基因文库的构建  79-80
  5.3 展望  80-81
致谢  81-82
参考文献  82-99
附录A 攻读硕士期间发表论文  99

云南蚕豆叶片铝胁迫响应基因的筛选与表达分析

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