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嗜鱼外瓶霉（Exophiala pisciphila ACCC32496）镉耐性机制研究

作　者: 湛方栋
导　师: 赵之伟
学　校: 云南大学
专　业: 微生物学
关键词: 深色有隔内生真菌 嗜鱼外瓶霉 镉 富集特征 耐性机理
分类号: X174
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


铅锌矿产资源的开采导致铅锌矿区镉(Cd)严重污染,是云南省重大环境问题之一。在Cd严重污染的铅锌矿区自然生长的野生植物根部普遍定殖着深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes, DSE),提示着DSE在铅锌矿区野生植物适应重金属胁迫中可能发挥着重要作用。研究分离自铅锌矿区的DSE对Cd的耐性及其机理,有助于阐明DSE在重金属严重污染的铅锌矿区这一特殊生态系统中的功能地位,解释铅锌矿区DSE与野生植物重金属耐性的关系；对于探索利用植物根部定殖的DSE,提高植物耐受重金属能力,重建重金属污染环境植被具有重要的理论和实践意义。本研究以分离自重金属严重污染的云南省会泽铅锌矿区自然生长的密序野古草(Arundinella bengalensis (Spreng.) Druce)根内的1株DSE真菌—嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)为研究对象,浓度为0-400mg/L的Cd胁迫处理下,研究菌丝Cd富集量、Cd化学形态与亚细胞分布、细胞壁Cd吸附能力与特征、Cd吸附基团、菌丝黑色素性质与特征、低分子量有机酸分泌、矿质营养、抗氧化系统等方面的内容,分析该菌株耐受Cd的胞外与胞内机制,得到以下主要结果：(1) E. pisciphila ACCC32496有很强的Cd耐性和富集能力。固体和液体培养情况下,采用直线内插法计算Cd对E. pisciphila ACCC32496的半数生长抑制浓度值(EC50),分别为332.2和111.2mg/L。Cd浓度为400mg/L时,E. pisciphila ACCC32496菌丝的Cd含量达到51.43mg/g干菌丝。(2)采用扫描电镜—能谱、透射电镜和透射电镜—能谱分析,结合差速离心法分离E. pisciphila ACCC32496菌丝亚细胞组分(细胞壁、细胞器和可溶性组分),发现Cd主要分布在菌丝细胞壁上。采用化学试剂逐步提取法,研究表明菌丝Cd的化学形态主要为醋酸提取态(FHAc)和氯化钠提取态(FNaCl)。(3)0.1M HCl和Na2EDTA从E. pisciphila ACCC32496菌丝解吸出来的Cd占菌丝Cd含量的63.0%-83.5%,0.1M CaCl2能够解吸8.3%-43.8%,0.1M NaOH能够解吸0.9%-5.6%。(4)在初始Cd浓度为25～400mg/L, pH值5.0,转速120rpm和30℃条件下, E. pisciphila ACCC32496菌丝吸附Cd的过程符合Langmuir吸附等温模型,吸附Cd的动力学实验数据符合准二级速率方程。傅里叶红外光谱(FTIR)分析表明,吸附Cd的化学基团涉及氨基、酰氨基、羧基、羟基和磷酰基等。(5) E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素属于典型的DHN型黑色素。三环唑能特异性抑制E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素合成,浓度不高于10μg/ml的三环唑对E. pisciphila ACCC32496菌丝生长与孢子产生量没有明显影响。Cd浓度在50-350mg/L, E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素含量有显著增加。50～200mg/L Cd胁迫下,采用三环唑抑制E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素合成,该菌丝生物量显著小于正常菌丝,Cd富集量大于正常菌丝,表明黑色素在该菌株Cd耐性中有作用。(6)Cd胁迫导致E. pisciphila ACCC32496菌丝N、K和Fe含量显著下降,P、Mg和Ca含量显著增加,S含量在Cd浓度为100mg/L时显著增加。Cd胁迫促进E. pisciphila ACCC32496菌丝产酸,培养液pH值下降。采用高效液相色谱法(HPLC)分析培养液中的低分子量有机酸,表明E. pisciphila ACCC32496菌丝主要产生草酸,培养液中菌丝草酸分泌量随Cd处理浓度增加而显著增加。(7)Cd胁迫导致E. pisciphila ACCC32496菌丝超氧阴离子生成速率、MDA和H2O2含量显著增加。SOD酶与CAT酶活性、GSH与-SH化合物含量以及T-AOC在一定Cd浓度范围内,随着Cd浓度增加而增强。以上结果表明,分离自重金属污染严重的铅锌矿区的DSE菌株E. pisciphila ACCC32496对Cd有很强的耐性与富集能力。E. pisciphila ACCC32496对Cd的耐性机制：①胞外机制包括：增加低分子量有机酸的分泌,尤其是草酸的分泌；通过菌丝细胞壁对的Cd吸附作用,以及增加细胞壁上的特殊组分—黑色素的合成。②胞内机制包括：通过增强菌丝细胞内SOD, CAT等抗氧化酶的活性,增加GSH等巯基化合物的合成,以及提高菌丝中P, S、Mg和Ca等矿质元素的含量,提高E. pisciphila ACCC32496对Cd的耐受能力。本文通过铅锌矿区典型DSE菌株对Cd的富集特征和耐性机制的初步研究,有助于理解特殊生境—重金属严重污染的铅锌矿区中特殊生物类群—DSE的生态学功能,并为进一步研究DSE在重金属污染环境的植被重建与修复可能应用打下了一定的基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章 研究背景及选题依据  13-35
  1 深色有隔内生真菌(DSE)研究概况  13-19
    1.1 DSE的研究历史  13-14
    1.2 DSE的形态特征  14
    1.3 DSE的生态分布与功能  14-19
  2 嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila)研究概况  19-21
    2.1 外瓶霉(Exophiala)的研究概况  19-21
  3 丝状真菌耐受重金属的细胞机制  21-30
    3.1 丝状真菌对重金属的耐性  21-22
    3.2 丝状真菌耐受重金属的细胞机制  22-30
  4 本论文研究的选题背景  30-33
    4.1 土壤重金属污染  30-31
    4.2 铅锌矿区野生植物  31-32
    4.3 DSE与重金属耐性  32-33
  5 论文研究内容及技术路线  33-35
    5.1 胞外机制  33
    5.2 胞内机制  33
    5.3 技术路线  33-35
第二章 嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)对Cd的耐性与富集特征  35-49
  1. 前言  35-36
  2. 材料和方法  36-38
    2.1 供试菌株  36
    2.2 Cd处理与培养条件  36
    2.3 生长指标与EC_(50)测定  36
    2.4 菌丝Cd含量测定  36-37
    2.5 菌丝亚细胞组分Cd含量测定  37
    2.6 菌丝Cd化学形态测定  37
    2.7 菌丝扫描电镜—能谱观察  37-38
    2.8 菌丝透射电镜观察  38
    2.9 数据处理与分析  38
  3. 结果与分析  38-46
    3.1 Cd对E.pisciphila ACCC32496生长的影响  38-40
    3.2 E.pisciphila ACCC32496菌丝的Cd含量  40
    3.3 E.pisciphila ACCC32496菌丝Cd的亚细胞分布  40-41
    3.4 E.pisciphila ACCC32496菌丝Cd的化学形态  41-43
    3.5 E.pisciphila ACCC32496菌丝扫描电镜—能谱仪分析  43-44
    3.6 E. pisciphila ACCC32496菌丝透射电镜分析  44-46
  4. 讨论  46-48
    4.1 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝生长的影响  46
    4.2 Cd在真菌菌丝细胞中的亚细胞分布  46-47
    4.3 Cd在真菌菌丝中的化学形态与Cd富集解毒的关系  47-48
  5. 小结  48-49
第三章 嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)菌丝对Cd的吸附特征  49-61
  1. 前言  49
  2. 材料和方法  49-52
    2.1 供试菌株  49
    2.2 Cd处理与培养条件  49-50
    2.3 菌丝Cd解吸试验  50
    2.4 菌丝Cd吸附试验  50-51
    2.5 菌体吸附量计算  51
    2.6 菌丝傅立叶红外光谱(FHR)测定  51
    2.7 数据处理与分析  51-52
  3. 结果与分析  52-57
    3.1 解吸剂对E. pisciphila ACCC32496菌丝Cd的解吸作用  52-53
    3.2 E. pisciphila ACCC32496菌丝吸附Cd的影响因素研究  53-55
    3.3 E. pisciphila ACCC32496菌丝对Cd的吸附等温线  55-56
    3.4 E. pisciphila ACCC32496菌丝对Cd的吸附动力学  56-57
    3.5 E. pisciphila ACCC32496菌丝的红外光谱分析  57
  4. 讨论  57-60
    4.1 真菌菌丝吸附Cd的影响因素  57-58
    4.2 真菌菌丝吸附Cd的平衡与过程  58-59
    4.3 真菌菌丝吸附Cd的机理  59-60
  5. 小结  60-61
第四章 嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)菌丝黑色素的性质及其在Cd耐性的作用  61-76
  1. 前言  61
  2. 材料和方法  61-64
    2.1 供试菌株  61-62
    2.2 Cd处理与培养条件  62
    2.3 三环唑处理  62
    2.4 菌丝生长测定  62
    2.5 菌丝黑色素的提取与纯化  62
    2.6 菌丝黑色素含量测定  62
    2.7 菌丝黑色素理化性质的测定  62-63
    2.8 数据处理与分析  63-64
  3. 结果与分析  64-73
    3.1 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素含量的影响  64
    3.2 E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素的理化性质  64-67
    3.3 E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素的抗氧化活性  67-68
    3.4 抑制剂对E. pisciphila ACCC32496菌丝黑色素合成的影响  68-69
    3.5 三环唑对E. pisciphila ACCC32496形态与生长的影响  69-72
    3.6 三环唑对E. pisciphila ACCC32496 Cd耐性的影响  72-73
  4. 讨论  73-75
    4.1 天然黑色素类型与黑色素资源的多样性  73
    4.2 真菌黑色素的类型与功能  73-74
    4.3 黑色素提高真菌重金属耐性的作用机理  74-75
  5. 小结  75-76
第五章 Cd对嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)矿质营养与草酸分泌的影响  76-85
  1. 前言  76-77
  2. 材料和方法  77-78
    2.1 供试菌株  77
    2.2 Cd处理与培养条件  77
    2.3 菌丝大量和微量营养元素含量的测定  77
    2.4 菌丝产酸观察与测定  77-78
    2.6 菌丝培养液低分子量有机酸含量测定  78
    2.7 数据处理与分析  78
  3. 结果与分析  78-82
    3.1 Cd对E. pisciphila ACCC32496 NPK营养的影响  78-79
    3.2 Cd对E. pisciphila ACCC32496微量元素营养的影响  79-80
    3.3 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝产酸的影响  80-81
    3.4 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝草酸分泌的影响  81-82
  4. 讨论  82-84
    4.1 重金属胁迫条件下真菌菌丝矿质元素含量的变化  82-83
    4.2 矿质营养对重金属胁迫的缓解作用  83
    4.3 重金属胁迫条件下真菌菌丝低分子量有机酸的分泌与功能  83-84
  5. 小结  84-85
第六章 嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila ACCC32496)抗氧化系统对Cd的响应特征  85-105
  1. 前言  85-86
  2. 材料和方法  86-95
    2.1 供试菌株  86
    2.2 培养基与Cd处理  86
    2.3 可溶性蛋白含量测定  86-87
    2.4 氧化伤害产物的测定方法  87-90
    2.5 抗氧化酶活性的测定方法  90-92
    2.6 抗氧化物质含量的测定方法  92-94
    2.7 总抗氧化能力(T-AOC)的测定方法  94
    2.8 数据处理与分析  94-95
  3. 结果与分析  95-101
    3.1 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝可溶性蛋白含量的影响  95
    3.2 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝氧化伤害产物生成的影响  95-97
    3.3 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝抗氧化酶活性的影响  97-99
    3.4 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝GSH和-SH化合物含量的影响  99-101
    3.5 Cd对E. pisciphila ACCC32496菌丝总抗氧化能力的影响  101
  4. 讨论  101-104
    4.1 重金属胁迫条件下真菌菌丝可溶性蛋白含量的变化  101-102
    4.2 重金属胁迫条件下真菌菌丝伤害产物的累积  102
    4.3 真菌菌丝抗氧化酶对重金属胁迫的响应  102-103
    4.4 真菌菌丝抗氧化物质对重金属胁迫的响应  103-104
  5. 小结  104-105
第七章 总结与展望  105-107
  1 论文总结  105
  2 后续工作展望  105-107
参考文献  107-125
附录  125-130
  附录1 论文中使用的缩写及中英文对照  125-128
  附录2 论文中使用的试剂、缓冲液和培养基的配制  128-130
作者简介  130-132
  1. 作者简历  130
  2. 科研项目  130
  3. 科研奖励  130
  4. 发表论文  130-132
致谢  132-133

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境动物学
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