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白地霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达与高密度发酵研究

作　者: 智晓燕
导　师: 闫云君
学　校: 华中科技大学
专　业: 微生物学
关键词: 白地霉脂肪酶毕赤酵母双启动子透明颤菌血红蛋白摇瓶优化高密度发酵
分类号: TQ925.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸）具有高度底物特异性，可广泛应用于油脂改性、对映体药物拆分和生物柴油制备等领域。但其自然产量极低无法满足大规模应用的需要。因此，利用基因工程技术实现其异源高效表达，对该酶的工业化应用具有重要意义。本文构建了4种含有gcl基因的表达载体，同时构建了6种单启动子表达gcl基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组菌株、3种双启动子表达gcl基因的P.pastoris重组菌株和1种同时含有vgb基因和gcl基因的P. pastoris重组菌株。优化了含有gcl基因的P. pastoris重组菌株摇瓶发酵条件，将筛选得到的5种P. pastoris重组菌株进行了10-L发酵罐高密度发酵。主要研究内容和结果如下：1、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增gcl基因，构建了诱导型表达载体pPIC9K-gcl、pPICZα-gcl、pFLDZα-gcl和组成型表达载体pGAPZα-gcl，分别电转至P. pastoris GS115或X-33中，得到6种基因工程菌，分别是GS115/9Kgcl、X-33/Zα-gcl、GS115/Zα-gcl、X-33/FLD-gcl、GS115/FLD-gcl和X-33/GAP gcl。采用BMMY-橄榄油罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选到1株酶活力最高的转化子GS115/9Kgcl78#，初始酶活力达220U/mL，并对此菌株进行单因子摇瓶发酵优化。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96h，每24h甲醇添加量1%，接种量2%，培养基初始pH7.0，摇瓶装液量50mL(500mL摇瓶)，甲醇诱导温度25℃时，酶活力可达735U/mL，是初始酶活力的3.34倍。2、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)的基因vgb，构建载体pPICZX-vgb。以菌株GS115/9Kgcl78#为宿主，二次电转构建了3种双启动子重组菌和1种同时含有vgb基因和gcl基因的耐低氧重组菌。摇瓶发酵筛选得到3个双启动子高活力菌株GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#和GS115/9Kgcl-GAPgcl63#，它们的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高40.8%，53.8%和27.5%。装液量100mL (500mL摇瓶)时，含有vgb基因的耐低氧重组菌株GS115/9Kgcl-ZXvgb43#，能够减弱低氧对GCL表达的抑制作用。3、运用基于TaqMan探针法的荧光定量PCR技术确定了重组菌GS115/9Kgcl68#、 GS115/9Kgcl78#、 GS115/9Kgcl86#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#、GS115/9Kgcl-GAPgcl-63#的gcl基因拷贝数分别为2、3、1、5、4和4。确定了GS115/9Kgcl-ZXvgb43#中含有1个vgb基因拷贝。将重组菌约63kDa目的蛋白在MALDI-TOF-TOF中进行蛋白质质谱分析，通过软件Mascot搜索数据库鉴定出重组菌表达的目的蛋白是GCL。经Endo H糖苷内切酶酶切的GCL约为60kDa，与预测GCL大小一致，证实了GCL在P. pastoris异源表达过程中存在糖基化修饰。4、在10-L发酵罐高密度发酵中，以FM22基础盐培养基生长菌体，以甲醇进行诱导，单启动子重组菌GS115/9Kgcl78#的酶活力为6200U/mL。重组菌GS115/9Kgcl-Zagcl51#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl26#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl63#和GS115/9Kgcl-ZXvgb43#的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高了45.2%、79.0%、35.5%和18.5%。其中，重组菌GS115/9Kgcl-Zαgcl26#的酶活力和酶活生产率较高，分别为11100U/mL和75.14U/(mL·h)，在这五种重组菌中均处于最高水平。本文利用双启动子策略和VHb共表达策略实现了GCL在P. pastoris中的高效表达，筛选到的重组菌在摇瓶和10-L发酵罐水平均获得很高的表达量，为GCL的工业化生产奠定了坚实的技术基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪论  10-28
  1.1 脂肪酶概述  10-14
  1.2 白地霉脂肪酶  14-18
  1.3 毕赤酵母表达系统  18-26
  1.4 本研究的目的与意义  26-28
2 白地霉脂肪酶重组菌的构建、筛选及摇瓶发酵优化  28-60
  2.1 实验材料  28-33
  2.2 实验方法  33-42
  2.3 结果与分析  42-58
  2.4 讨论与小结  58-60
3 利用双启动子和 VHb 共表达策略提高毕赤酵母中重组 GCL 表达量  60-90
  3.1 实验材料  61-62
  3.2 实验方法  62-68
  3.3 结果和分析  68-86
  3.4 小结与讨论  86-90
4 多种工程菌高密度发酵生产 GCL 的对比研究  90-112
  4.1 实验材料  90-91
  4.2 实验方法  91-93
  4.3 结果与分析  93-109
  4.4 小结与讨论  109-112
5 全文总结  112-114
致谢  114-116
参考文献  116-125
附录 1 攻读硕士学位期间发表论文目录  125-126
附录 2 基因序列  126-127

白地霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达与高密度发酵研究

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