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猪乳铁蛋白及其肽在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及生物学功能的初步研究

作　者: 邢婧珉
导　师: 唐丽杰
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: LFcinP pLF-319 毕赤酵母基因优化组成型表达生物学功能
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白,分子中含有两个铁结合位点,是两个相似的叶片状结构,分别被命名为N-叶和C-叶,2个叶片分别由一个短肽链所连接,具有抗菌,抗病毒,抗肿瘤,抗氧化,免疫调节和促进肠道有益菌群生长等多种生理功能。乳铁蛋白肽是乳铁蛋白在消化道内经酸性胃蛋白酶水解后的小肽,它位于乳铁蛋白N-叶中的17～42氨基酸残基之间,其功能与乳铁蛋白的功能密切相关,除不能结合铁离子外,乳铁蛋白肽几乎具备乳铁蛋白的所有生物学活性,并且杀菌活性比乳铁蛋白高。由于乳铁蛋白的广泛生物学功能,同时其来源受限,因此以基因工程技术生产乳铁蛋白及其肽是其在生产中应用的主要趋势。本研究为获得猪乳铁蛋白及其肽的基因工程表达,选用真核表达系统——巴斯德毕赤酵母为宿主菌,以组成型表达质粒pGAPHaM作为表达载体,构建无需诱导表达的重组酵母菌株。根据NCBI数据库公布的牛、羊、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列和相关文献报道,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行了理化性质分析,并参照巴斯德毕赤酵母使用密码子的偏好性,优化设计并合成了138bp的编码46个氨基酸的猪乳铁蛋白肽的LFcinP基因；同时用本实验室保存的天然猪乳铁蛋白N-叶基因扩增951bp的片断,共编码319个氨基酸的猪乳铁蛋白N-叶,命名为pLF-319,通过pGAPHaM酵母组成型分泌表达载体将LFcinP和pLF-319分别整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株基因组上,获得了表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因的重组酵母菌株pGAPHaM-LFcinP/GS115和表达pLF-319基因的pGAPHaM-pLF-319重组菌株；SDS-PAGE和、Vestern-blot分析表明分别表达了约5.4kDa的猪乳铁蛋白肽LFcinP和约35kDa的pLF-319重组蛋白；用Bandscan软件分析96h的pG APHaM-LFcinP/GS115和pGAPHaM-pLF-319/GS115的浓缩上清蛋白电泳带,结果表明重组蛋白LFcinP占重组巴斯德毕赤酵母pGAPHaM-LFcinP/GS115上清蛋白的35.9%,表达量约48.5μg/mL；重组蛋白pLF-319占巴斯德毕赤酵母pGAPHaM-pLF-319/GS115上清蛋白的6.9%,表达量约为9.18μg/mL。动态生长曲线法抑菌试验结果表明重组猪乳铁蛋白肽LFcinP和乳铁蛋白N-叶pLF-319对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌5taphylococcus aureas CVCC25923株和革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli CVCC10141均有一定的抑菌作用。以断乳BALB/c小鼠为模型动物,将断乳小鼠分为4组,每组12只,不同组分别口服饲喂PBS缓冲液,GS115上清,重组菌pGAPHaM-LFcinP/GS115上清,重组菌pGAPHaM-pLF-319/GS115上清,每日以饮水的方式进行饲喂,每日饲喂8h水,剩余16h不同组别分别饮用PBS、GS115上清,pGAPHaM-LFcinP/GS115上清、pGAPHaM-pLF-319/GS115上清液,连续21d,检测重组猪乳铁蛋白及肽能否提高断乳小鼠对鼠粮的利用率,促进断乳小鼠生长,以及对血清生化指标的影响情况。对各组断乳小鼠的每日进食量、饮水量、断乳小鼠的体重和身长进行了测量,结果表明口服重组菌的实验组鼠粮利用率分别为14.8%(pGAPHaM-LFcinP/GS115俎)和12.7%(pGAPHaM-pLF-319/GS115组),高于对照组未重组酵母菌GS115上清组(10.6%)和PBS组(8.72%)；身长测定结果表明,服用重组菌平均身长增长量为5.57cm (pGAPHaM-LFcinP/GS115组)和5.79cm (pGAPHaM-pLF-319/GS115组)高于PBS组(4.5cm)和GS115组(4.25cm)；血清检测结果表明,与PBS和GS115上清对照组相比口服LFin P和pLF-319组提高了总蛋白含量和血清球蛋白的含量(P<0.05)；不同组别之间,总胆固醇,葡萄糖浓度均未产生显著差异,LFcinP组和pLF-319组显著提高了总胆红素水平,直接胆红素水平和间接胆红素水平(P<0.05)；各处理组之间碱性磷酸酶未产生显著差异,与PBS组和GS115组相比LFcinP组和pLF-319组谷丙转氨酶活性显著降低(P<0.05),乳酸脱氢酶活性显著提高(P<0.05)。以上结果可见重组的猪乳铁蛋白及肽可以提高断乳小鼠的消化系统功能,增强断乳小鼠的免疫机能,对断乳小鼠生长发育具有促进作用。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-22
  1.1 乳铁蛋白及乳铁蛋白肽的分子结构  12-13
  1.2 乳铁蛋白与乳铁蛋白肽的生物学功能  13-16
    1.2.1 抗菌及抗病毒功能和机理  13-14
    1.2.2 免疫调节作用  14-15
    1.2.3 抗氧化作用和抗肿瘤活性  15-16
  1.3 乳铁蛋白及乳铁蛋白肽的真核表达系统研究进展  16-17
    1.3.1 真菌表达系统  16
    1.3.2 植物表达系统  16-17
    1.3.3 动物表达系统  17
  1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展  17-21
    1.4.1 毕赤酵母表达系统的优点  17-18
    1.4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的组成  18-20
    1.4.3 巴斯德毕赤酵母作为外源基因表达载体的应用  20-21
  1.5 研究目的与意义  21-22
2 材料与方法  22-34
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 菌种与质粒  22
    2.1.2 实验动物  22
    2.1.3 试剂盒及抗体制剂  22
    2.1.4 引物  22
    2.1.5 实验试剂  22-23
    2.1.6 主要溶液配制  23
  2.2 试验方法  23-34
    2.2.1 猪乳铁蛋白肽LFcinP基因的设计合成和pLF-319的扩增  23-25
    2.2.2 pLF-319基因与T载体连接  25-27
    2.2.3 表达载体pGAPHαM-LFcinP和pGAPHαM-pLF-319的构建  27-30
    2.2.4 表达LFcinP和pLF-319重组巴斯德毕赤酵母的构建  30-31
    2.2.5 重组巴斯德毕赤酵母的蛋白表达及鉴定  31-32
    2.2.6 体外抑菌活性检测  32
    2.2.7 口服重组巴斯德毕赤酵母上清后小鼠生理指标的测定  32-34
3 结果  34-46
  3.1 重组质粒pUC57-LFcinP和pMD18-T pLF-319的鉴定结果  34
  3.2 重组质粒pGAPHαM-xyn2的鉴定  34-35
  3.3 重组质粒pGAPHαM-LFcinP和pGAPHαM-pLF-319的鉴定  35-36
  3.4 pGAPHαM-LFcinP/GS115和pGAPHαM-pLF-319/GS115重组菌株的鉴定  36-38
  3.5 pGAPHαM-LFcinP/GS115和pGAPHαM-pLF-319/GS115重组菌株表达蛋白的鉴定  38-40
    3.5.1 表达产物SDS-PAGE鉴定  38-39
    3.5.2 表达产物的Western blot鉴定  39-40
  3.6 重组猪乳铁蛋白及其肽的体外与体内试验结果  40-46
    3.6.1 时间动态曲线法测量抑菌活性  40-42
    3.6.2 断乳小鼠口服重组菌上清后生长指标的测定结果  42-44
    3.6.3 重组猪乳铁蛋白pLF-319及LFcinP肽对断乳小鼠血清生化指标的影响结果  44-46
4 讨论  46-49
  4.1 本实验的主要研究内容及潜在价值  46
  4.2 猪乳铁蛋白及其肽的相关生物学功能  46-47
  4.3 基因设计与载体选择  47-49
5 结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-55
附录  55-59
攻读硕士学位期间发表的学术论文  59

猪乳铁蛋白及其肽在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及生物学功能的初步研究

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