学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

色素荧光蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中表达

作　者: 常坤
导　师: 赵开弘
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 绿色荧光蛋白 藻蓝色素 光敏色素 荧光探针 巴斯德毕赤酵母
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 126次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


绿色荧光蛋白(GFP)具有优异的荧光活性,作为报告基因与靶蛋白融合,示踪靶蛋白在活细胞内的位置、移动及相互作用。蓝细菌中的色素蛋白具有丰富的光谱范围,可弥补绿色荧光蛋白光谱的不足,拓展荧光蛋白标签在细胞生物学研究中的应用。绿色荧光蛋白与色素蛋白的融合进一步拓宽光谱的检测范围,能用作二色、多色标记,可作荧光探针用于定位。另外,蓝细菌中色素蛋白潜在的生物活性也引起人们的重视,如作为光敏剂和抗氧化活性用于光动力学治疗。本文研究包括以下几个方面：(1)绿色荧光蛋白肌动蛋白融合基因的克隆与在原核表达系统中表达。首先从大肠杆菌中克隆出肌动蛋白基因mreB,与gfp基因融合,构建质粒pCDFDuet-mreB:gfp,转入大肠杆菌,经荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征以及蛋白质电泳结果证明融合基因在大肠杆菌中表达。(2)绿色荧光蛋白和胆绿素还原酶基因pcyA在毕赤酵母菌株GS115中表达。首先构建酵母质粒pPICZB-gfp和pPICZB-gfp:pcyA,以电转化方式分别导入巴斯德酵母菌株GS115基因组中,筛选阳性克隆子,进行诱导表达。由荧光显微镜图像,荧光和吸收光谱特征以及蛋白质电泳结果证明gfp基因和gfp.pcyA融合基因在酵母中表达成功,初步建立毕赤酵母表达系统,构建出外源蛋白的酵母表达平台。(3)毕赤酵母双色荧光蛋白表达体系的构建。首先克隆出酵母线粒体膜蛋白基因f0并与gfp(△SacI):pcyA基因融合,构建酵母表达质粒pPIC3.5K:f0:gfP(△SacI):pcyA,以电转化方式导入菌株GS115基因组中,得到的阳性克隆子诱导表达。通过荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征筛选出工程菌GS115/pPIC3.5K:f0:gfp(△SacI):pcyA。然后构建含GAF3结构域的光敏色素酵母质粒pPICZB:abpl:gaf3:hol,同样以电转化方式导入工程菌GS115/pPIC3.5K:f0:gfp(△SacI):pcyA基因组中。经PCR筛选的阳性克隆子,在BMMY培养基中诱导表达,通过荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征等方式检测,光敏色素蛋白在毕赤酵母中未能表达成功,需进一步探索。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
縮略语表  10-11
第一章 文献综述  11-24
  1.1 蓝藻与藻胆体  11-12
  1.2 藻胆蛋白  12-14
  1.3 藻胆色素的生物合成  14-16
  1.4 光敏色素  16-18
  1.5 荧光蛋白的研究进展  18-19
  1.6 毕赤酵母的研究进展  19-23
    1.6.1 毕赤酵母的优势  20
    1.6.2 毕赤酵母的表达宿主菌  20-21
    1.6.3 毕赤酵母的表达载体  21
    1.6.4 毕赤酵母的密码子分析  21
    1.6.5 外源基因的表达  21-22
    1.6.6 毕赤酵母表达系统的局限性  22-23
  1.7 本课题研究的目的和意义  23-24
第二章 绿色荧光蛋白的定位标记  24-37
  2.1 引言  24
  2.2 实验材料  24-27
    2.2.1 菌株和质粒  24-25
    2.2.2 培养基  25
    2.2.3 所用试剂  25-26
    2.2.4 实验仪器  26-27
  2.3 实验方法  27-33
    2.3.1 菌种的活化和培养  27-28
    2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化  28
    2.3.3 碱裂解法抽提质粒  28
    2.3.4 从琼脂糖凝胶中回收DNA  28-29
    2.3.5 引物设计和标准PCR扩增  29-30
    2.3.6 表达载体pCDFDuet-mreb：gfp的构建  30-31
    2.3.7 质粒pCDFDuet-mreb：gfp在原核生物中表达  31
    2.3.8 含His-tag融合标签蛋白的亲和纯化  31-32
    2.3.9 融合蛋白的活性检测  32-33
  2.4 结果与分析  33-36
    2.4.1 重组质粒pCDFDuet-mreb:gfp的双酶切检测  33
    2.4.2 融合蛋白荧光显微镜的检验  33-34
    2.4.3 融合蛋白的吸收光谱和荧光光谱分析  34-35
    2.4.4 融合蛋白的SDS-PAGE检测  35-36
  2.5 小结与讨论  36-37
第三章 绿色荧光蛋白和藻蓝色素相关基因在酵母中表达  37-53
  3.1 引言  37
  3.2 实验材料  37-39
    3.2.1 菌株和质粒  37-38
    3.2.2 培养基  38
    3.2.3 所用试剂  38-39
    3.2.4 实验仪器  39
  3.3 实验方法  39-44
    3.3.1 菌种的活化和培养  39-40
    3.3.2 重组酵母载体的构建  40
    3.3.3 重组酵母载体的线性化  40-41
    3.3.4 线性化重组载体转化到毕赤酵母  41
    3.3.5 毕赤酵母电转化法  41-43
    3.3.6 毕赤酵母工程菌的构建  43-44
    3.3.7 毕赤酵母工程菌的活性检测  44
  3.4 结果与分析  44-52
    3.4.1 重组质粒双酶切检测  44-45
    3.4.2 毕赤酵母的转化  45-46
    3.4.3 酵母菌阳性转化子的PCR验证  46-47
    3.4.4 酵母菌阳性转化子的荧光显微镜检验  47-48
    3.4.5 酵母菌阳性转化子的荧光光谱和吸收光谱分析  48-50
    3.4.6 酵母菌阳性转化子SDS-PAGE检测  50-52
  3.5 小结与讨论  52-53
第四章 毕赤酵母双色荧光蛋白表达体系的构建  53-66
  4.1 前言  53
  4.2 实验材料  53-54
    4.2.1 菌株和质粒  53
    4.2.2 培养基  53-54
    4.2.3 所用试剂  54
    4.2.4 实验仪器  54
  4.3 实验方法  54-57
    4.3.1 重组载体pPIC3.5K-f0：gtp(△SacI)：pcyA的构建  54-55
    4.3.2 重组载体pPICZB：abp1：gaf3：ho1的构建  55
    4.3.3 酵母重组载体线性化  55
    4.3.4 酵母菌单色荧光蛋白体系的构建  55-56
    4.3.5 酵母菌双色荧光蛋白体系的构建  56
    4.3.6 工程菌诱导表达  56
    4.3.7 工程菌细胞破碎  56-57
    4.3.8 工程菌检测  57
  4.4 结果与分析  57-64
    4.4.1 重组质粒双酶切检测  57-58
    4.4.2 酵母阳性转化子的PCR验证  58-59
    4.4.3 酵母阳性转化子的显微镜检测  59-62
    4.4.4 酵母阳性转化子的荧光光谱和吸收光谱分析  62-64
  4.5 小结与讨论  64-66
参考文献  66-74
附录 附图  74-76
致谢  76

相似论文

  1. 单细胞中光敏化单态氧的间接成像,Q2-3
  2. ‘突尼斯软籽’石榴再生体系和GFP报告基因的瞬时表达研究初报,S665.4
  3. 禾谷镰刀菌致病相关基因的鉴定及其毒素DON特异亲和肽段的淘选,S432.4
  4. 金属硫蛋白基因工程菌的构建及其对重金属响应的研究,Q78
  5. 香豆素类荧光探针的合成及表征,O657.3
  6. 复混肥中缩二脲对作物毒害的临界值与缩二脲降解菌的研究,S143
  7. 荧光法测定有机磷农药残留量及应用,O657.39
  8. 树枝状重金属离子荧光探针研究,O626
  9. Pseudomonas stutzeri LYS-86反硝化基因克隆及荧光标记,X172
  10. 量子点选择性荧光探针在生化检测中的应用研究,Q503
  11. 巴氏杜氏藻psy侧翼调控序列的克隆及其环境因子调控元件分析,S917.3
  12. 多选择标记植物表达载体的构建,Q943.2
  13. 含硫功能性配合物的合成和性能初探,O622.7
  14. 两种结直肠癌肝转移模型建立方法,R735.3
  15. 上转换发光基质-NaYF_4纳米粒子的反转胶束法合成,TB383.1
  16. 小鼠囊胚与黑色素瘤细胞体外共培养模型优化,Q813
  17. pIRES-GFP-hPENK的构建及其鞘内注射的表达,R450
  18. pEGFP-C3-PENK在NIH3T3细胞中表达及其产物的活性检测,R402
  19. CdTe量子点的合成及其初步应用,Q503
  20. 铕荧光探针及其在药物和DNA分析中的应用,Q503
  21. 量子点@二氧化硅核—壳型纳米探针的合成及性能,O613.72

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com