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小鼠miR-200家族在体型控制和脂肪形成中的功能研究

作　者: 任红艳
导　师: 李奎
学　校: 中国农业科学院
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: miR-200家族条件基因敲除体型控制脂肪形成小鼠
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

microRNA-200家族在多种上皮来源肿瘤中的表达和功能一直是科学家们研究的热点,而关于miR-200家族对动物体型控制方面的研究很少。2009年,研究者发现果蝇miR-8基因在调控果蝇体型尺寸方面具有重要作用,敲除了miR-8基因的果蝇体型明显变小。作为miR-8在哺乳动物中的同源基因,miR-200家族基因是否也具有类似的功能以及其发挥作用的机制值得我们进行深入研究。本研究的目的就是对miR-200家族在哺乳动物体型控制中的作用进行分析。miR-200家族包含miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共五个成员,根据其在染色体上的位置可以分为两个基因簇：miR-200b/miR-200a/miR-429和miR-200c/miR-141基因簇。本研究利用Cre-loxp系统制备了miR-429/200a/200b基因簇条件打靶小鼠,将其与脂肪组织特异性表达Cre酶转基因小鼠杂交,获得了脂肪组织中特异性剔除miR-429/200a/200b基因簇的小鼠。对敲除小鼠的生长曲线、代谢指标、生理生化指标及组织形态学等多个方面进行表型分析,结果发现：miR-429/200a/200b基因簇剔除小鼠无胚胎致死性；敲除小鼠在4周龄开始出现生长减缓,其体内脂肪量较对照小鼠减少50%；敲除小鼠表现出葡萄糖耐受性增加和胰岛素抵抗,并由此引发小鼠血液中IGF1浓度降低和脂联素水平升高；组织学分析显示敲除小鼠脂肪、肌肉等组织无明显病变,但肝脏中变性坏死区域增多；通过miR-200靶标基因预测和互作分析,我们发现PI3K-Akt-mTOR等生长和脂肪形成相关信号通路被抑制是导致miR-429/200a/200b基因剔除小鼠出现体重减轻、脂肪减少的主要原因。我们的实验结果首次提供了体内的遗传学证据证明miR-200家族分子在哺乳动物体型控制和脂肪形成中的重要作用。提出miR-200家族与PI3K-Akt-mToR信号通路互作引起脂肪形成被抑制的作用机制。脂肪组织特异性miR-429/200a/200b基因剔除小鼠的成功研制为深入研究脂肪细胞分化机制以及治疗相关代谢疾病提供较理想的动物模型,miR-200家族与PI3K-Akt-mToR信号通路互作机制的剔除将为更深入的揭示miR-200家族在动物生长发育调控中的功能研究提供更多的理论参考。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
第一章、前言  8-16
  1.1 MICRORNA研究进展  8-11
    1.1.1 microRNA生成过程  8-9
    1.1.2 miRNA的结构与生物学特性  9
    1.1.3 miRNA的作用方式  9-10
    1.1.4 miRNA与动物发育和人类疾病的关系  10-11
  1.2 MICRORNA200S家族基因研究进展  11-13
    1.2.1 miR-200s基因簇基因组构成  11-12
    1.2.2 miR-200家族表达、靶标验证及功能研究进展  12-13
    1.2.3 miR-200家族与体型控制的关系  13
  1.3 动物体型控制机理研究进展  13-15
  1.4 研究的目的和意义  15-16
第二章小鼠MIR-200S基因分离、表达谱分析及靶基因预测与鉴定  16-23
  2.1 材料和方法  16-19
    2.1.1 序列查找和引物设计  16
    2.1.2 miR-200靶基因的预测和验证  16-17
    2.1.3 组织表达谱分析  17-18
    2.1.4 miRNA前体真核表达载体构建  18-19
    2.1.5 重组质粒转染Hepa1-6细胞  19
  2.2 实验结果  19-22
    2.2.1 mmu-miR-200s家族基因分子特征  19
    2.2.2 mmu-miR-200a/200b前体及侧翼序列获得  19-20
    2.2.3 miR-200s在成年鼠各组织中的表达情况  20-21
    2.2.4 小鼠miR-200基因家族靶标预测与验证  21-22
  2.3 讨论  22-23
第三章脂肪组织特异性敲除MIR-200基因簇的小鼠模型建立  23-30
  3.1 材料与方法  23-25
    3.1.1 基因敲除载体构建  23-24
    3.1.2 ES细胞同源重组  24
    3.1.3 重组ES细胞的囊胚腔注射  24
    3.1.4 Loxp-floxed小鼠基因型鉴定  24
    3.1.5 miR-200s脂肪特异敲除小鼠制备  24-25
  3.2 结果  25-30
    3.2.1 脂肪组织特异性miR-429/200a/200b基因簇敲除策略  25-26
    3.2.2 敲除载体构建  26
    3.2.3 中靶ES细胞的筛选  26-28
    3.2.4 loxp-floxed(fln)小鼠基因型检测  28
    3.2.5 脂肪组织中特异敲除miR-200a/200b/429小鼠制备与鉴定  28-30
第四章脂肪组织特异性MIR-200基因簇敲除小鼠表型分析  30-40
  4.1 材料与方法  30-33
    4.1.1 实验动物  30
    4.1.2 葡萄糖耐受性检测  30-31
    4.1.3 胰岛素抵抗性检测  31
    4.1.4 小鼠机体脂肪含量分析  31-32
    4.1.5 小鼠血清IGF1、脂联素的测定(ELISA法)  32
    4.1.6 小鼠的组织学分析  32-33
  4.2 结果  33-40
    4.2.1 敲除小鼠脂肪组织中miR-200s表达量检测结果  33
    4.2.2 miR200s-/+敲除小鼠生长情况  33-34
    4.2.3 miR200s-/+敲除小鼠器官称重及骨密度分析结果  34-35
    4.2.4 miR200s~(-/+)敲除小鼠代谢指标检测  35-36
    4.2.5 miR200s~(-/+)敲除小鼠血液生化指标检测  36-37
    4.2.6 miR200s~(-/+)敲除小鼠组织形态学分析  37-38
    4.2.7 miR200s靶基因检测及通路分析  38-40
讨论  40-43
结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-48
个人简历  48-49

小鼠miR-200家族在体型控制和脂肪形成中的功能研究

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