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玉米茎节再生体系建立及农杆菌介导AGPase基因转化玉米的研究

作　者: 张曼
导　师: 原亚萍
学　校: 吉林大学
专　业: 植物学
关键词: 玉米 淀粉 茎节 AGPase基因 农杆菌介导法
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


玉米（Zea mays L.），一年生，禾本科植物，是世界上最重要的农作物之一，被广泛用做饲料、工业原料。玉米淀粉是玉米籽粒的主要成分，我国玉米的淀粉研究，相比于发达国家，在遗传育种、加工利用等方面都还有很长一段路要走，而将基因工程与传统育种的方法相结合是提高玉米淀粉含量的重要途径之一。在玉米遗传转化中，建立良好的受体系统是实现基因转化的先决条件。本实验以8个玉米自交系的茎节为外植体，建立了茎节再生体系。与愈伤组织再生体系相比，该体系可以在较短的时间内再生成苗，具有不受基因型和季节限制等优点。利用农杆菌介导法将玉米AGPase基因转入玉米自交系郑58的茎节中，获得了转基因植株，为玉米遗传转化开辟了一条新途径。主要研究内容和结果如下：1.成功构建了双价植物表达载体pCAMBIA3301-ZmAGPS::pHorD-RP5::ZmAGPL。质粒的T-DNA区含有ZmAGPL和ZmAGPS两个目的基因，分别由胚乳特异性启动子RP5和HorD驱动。2.以玉米自交系郑58的茎节为外植体，从激素浓度、无菌苗和茎节大小等方面进行了相关实验，建立了一套稳定的玉米茎节再生体系。结果表明：生根培养基中NAA的浓度为0.3-0.5mg L-1、无菌苗大小为4.5-5cm时切取茎节且茎节上下部各保留0.5cm时，茎节的再生率最高。对8个玉米骨干自交系的茎节进行再生培养，再生率均达到92%以上。3.对郑58的茎节进行石蜡切片的组织学观察，观察到分生组织和叶原基。4.农杆菌介导法将玉米AGPase基因导入玉米茎节受体系统中，在双丙氨磷浓度为3mg L-1的培养基上进行筛选。对筛选后得到的抗性植株进行PCR检测和PCR-Southern杂交验证，获得了转ZmAGPL基因的T0代阳性植株4株，PCR阳性率为6.06%。

全文目录


中文摘要  5-6
Abstract  6-12
第1章 文献综述  12-26
  1.1 玉米淀粉的研究进展  12-18
    1.1.1 玉米淀粉的理化特性  12-14
    1.1.2 玉米淀粉合成的关键酶  14-18
  1.2 玉米转基因受体  18-19
  1.3 遗传转化的方法  19-24
    1.3.1 农杆菌介导法  20-22
    1.3.2 基因枪法  22
    1.3.3 花粉管通道法  22-24
  1.4 转基因检测方法  24-25
  1.5 本论文研究的目的和意义  25-26
第2章 玉米 AGPase 基因植物双价表达载体构建  26-41
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 菌种与载体  26-27
    2.1.2 实验药品与试剂配制  27
    2.1.3 培养基  27-28
    2.1.4 实验仪器  28
  2.2 实验方法  28-36
    2.2.1 实验所用的引物  28
    2.2.2 玉米 AGPS 基因的克隆  28-32
    2.2.3 双价载体的构建  32-36
  2.3 实验结果  36-39
    2.3.1 基因的克隆  36-37
    2.3.2 双价植物表达载体的构建  37-38
    2.3.3 大肠杆菌质粒转化农杆菌的鉴定  38-39
  2.4 讨论  39-41
    2.4.1 植物双价表达载体的构建  39
    2.4.2 启动子的选择  39-40
    2.4.3 农杆菌鉴定方法  40
    2.4.4 载体构建方法  40-41
第3章 玉米茎节培养再生体系的建立  41-55
  3.1 实验材料  41-42
    3.1.1 植物材料  41
    3.1.2 实验药品以及试剂配制  41
    3.1.3 实验仪器  41
    3.1.4 培养基配方  41-42
  3.2 实验方法  42-45
    3.2.1 激素对茎节再生的影响  42-43
    3.2.2 无菌苗的长度对茎节再生的影响  43
    3.2.3 茎节大小对茎节再生的影响  43
    3.2.4 基因型对茎节再生的影响  43
    3.2.5 玉米茎节再生体系建立  43-44
    3.2.6 组织学观察  44-45
  3.3 结果  45-52
    3.3.1 激素对再生体系的影响  45-47
    3.3.2 无菌苗长度和茎节大小对茎节再生的影响  47-50
    3.3.3 基因型对茎节再生的影响  50
    3.3.4 玉米茎节再生体系的建立  50-51
    3.3.5 组织学观察  51-52
  3.4 讨论  52-55
    3.4.1 再生体系的比较  52-53
    3.4.2 酸水解酪蛋白和光照对再生体系的影响  53
    3.4.3 炼苗和移栽要注意的问题  53-55
第4章 农杆菌介导玉米茎节的遗传转化  55-66
  4.1 实验材料  55-57
    4.1.1 植物材料  55
    4.1.2 质粒和菌株  55
    4.1.3 实验仪器  55
    4.1.4 实验所需试剂以及配制  55-56
    4.1.5 实验所需培养基  56
    4.1.6 PCR 检测引物  56-57
  4.2 方法  57-61
    4.2.1 双丙氨磷筛选浓度的确定  57
    4.2.2 农杆菌介导玉米茎节的遗传转化  57
    4.2.3 CTAB 法提取植物叶片 DNA  57-58
    4.2.4 PCR 检测  58-59
    4.2.5 PCR-Southern 杂交  59-61
  4.3 结果  61-64
    4.3.1 玉米茎节双丙氨磷筛选浓度的确定  61-62
    4.3.2 农杆菌介导玉米茎节的遗传转化  62-63
    4.3.3 PCR 检测和 PCR-Southern 杂交验证  63-64
  4.4 讨论  64-66
    4.4.1 双丙氨磷的选择  64-65
    4.4.2 转基因植株授粉  65-66
结论  66-67
参考文献  67-79
作者简介  79-80
致谢  80

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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