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冰川土壤低温脂肪酶基因多样性研究及其基因克隆

作　者: 张宇宏
导　师: 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农业微生物学
关键词: 脂肪酶基因多样性宏基因组文库冰川土壤
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是分解三脂酰甘油的水解酶类,还可以催化酯合成、酯交换等反应,具有优良的底物特异性,立体选择性和有机溶剂稳定性。脂肪酶同时具有反应条件温和、副产物少、环境污染小等优点,因此广泛应用于工业生产。低温脂肪酶在反应温度较低的情况下仍具有高的催化效率,对热敏感,在洗涤剂、食品工业和污染土壤修复等领域中有重要应用价值。本研究目的是使用宏基因组技术研究冰川土壤中微生物脂肪酶基因的多样性,并采用传统纯培养方法从冰川土壤中筛选产脂肪酶微生物,克隆脂肪酶基因并进行异源表达,以验证脂肪酶基因功能。基因多样性研究中获得的脂肪酶基因片段有望用于从冰川土壤中克隆脂肪酶基因。对脂肪酶HSL(Hormone-sensitive Lipase)家族中的低温脂肪酶氨基酸序列进行比对,比对结果显示序列中存在两个保守区域[V/L]-[F/Y/D]-[F/I]-H-G-G-[G/A]和G-[D/V]-S-[A/V]-G-G-[N/C]- [L/M],分别位于脂肪酶的氧阴离子洞和活性位点处。根据这两个保守区域设计了脂肪酶的简并引物CLF和CLR。从中国新疆一号冰川土壤中直接提取微生物宏基因组DNA,以此宏基因组DNA为模板,使用引物CLF和CLR扩增脂肪酶基因片段,扩增产物连接载体转化大肠杆菌构建了冰川土壤低温脂肪酶基因片段文库(GCLP)。选取文库中300个克隆测序,序列进行BLAST比对分析后确认其中201个克隆含有编码脂肪酶的基因片段,这些基因片段编码的氨基酸序列与GenBank中脂肪酶氨基酸序列一致性介于33–82%。对这201个脂肪酶基因片段的氨基酸序列构建系统进化树进行分析,结果显示GCLP文库中的脂肪酶序列与GenBank中低温脂肪酶有较高的相似性,而且序列多样性非常丰富,并发现其中一个进化簇与现有报道的脂肪酶基因进化距离较远,可能是一个未发现的HSL脂肪酶亚家族。从冰川土壤微生物中筛选得到了12株产脂肪酶菌株,其中来源于Brachybacterium和Mrakia两个属的脂肪酶目前尚未有文献报道。使用CLF和CLR引物从其中8株产脂肪酶菌株中克隆得到8个脂肪酶基因片段,相互之间氨基酸序列一致性介于27–87%。这8个脂肪酶基因片段与GCLP文库中已测序的201个脂肪酶基因片段比对,其中有4个片段没有在GCLP文库中找到对应序列,而另外4个片段能够在GCLP文库中找到完全一致的对应序列。选择以上4个能够和GCLP文库对应的基因片段和一个来源于Mrakia酵母的基因片段为基础,使用TAIL-PCR方法克隆得到了5个脂肪酶基因全长。五个脂肪酶基因LipM,Lip3A,LipXD,LipDB5,LipDB8分别编码836,320,318,310,313个氨基酸,与GenBank中的脂肪酶氨基酸序列一致性最高分别为43%,52%,54%,70%,71%,说明克隆得到的5个脂肪酶基因均为新的脂肪酶基因。使用同源建模的方法预测了Lip3A,LipXD和LipDB8的蛋白质三级结构。与耐热型的脂肪酶相比,这三个脂肪酶的蛋白质分子空间结构更为松散。LipDB5在大肠杆菌中进行表达,Lip3A和LipXD在毕赤酵母中进行表达。三个重组菌株诱导后均能够检测到脂肪酶活性,验证了基因的功能。重组表达后的粗酶液测定了温度相关的酶学性质。LipDB5,Lip3A和LipXD的最适温度分别为30,40和37°C,在10°C反应时,其相对酶活分别为47,17和33%。热稳定性测定结果表明,LipDB5经60°C处理30 min后,相对酶活剩余34%;Lip3A和LipXD经50°C处理30 min后,相对酶活分别剩余16和26%。以上结果表明LipDB5,Lip3A和LipXD这三个脂肪酶的最适反应温度均低于40°C,在10°C低温下仍具有催化活性,热稳定性较差,具有低温脂肪酶的特点。以上结果证明,使用简并引物PCR扩增基因序列的方法能够快速有效地评价复杂环境中脂肪酶基因的多样性。而且在多样性研究中大量脂肪酶基因片段的获得也为将来从环境宏基因组文库中高通量筛选大量新的脂肪酶基因奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章绪论  14-28
  1.1 脂肪酶概述  14-17
    1.1.1 脂肪酶的定义和功能  14
    1.1.2 脂肪酶的来源和分类  14-16
    1.1.3 脂肪酶的酶学特性  16
    1.1.4 脂肪酶的结构特点  16-17
  1.2 低温脂肪酶的研究进展  17-23
    1.2.1 低温微生物及低温酶的特点  17
    1.2.2 低温脂肪酶适应低温的机制  17-19
    1.2.3 低温脂肪酶的来源及筛选  19-20
    1.2.4 低温脂肪酶的应用领域  20-23
  1.3 微生物多样性和基因多样性的研究进展  23-26
    1.3.1 研究微生物多样性和基因多样性的意义  23-24
    1.3.2 分子水平研究微生物功能基因多样性的方法  24-25
    1.3.3 利用宏基因组技术研究微生物功能基因多样性  25
    1.3.4 宏基因组文库的筛选方法  25-26
  1.4 本研究的目的和意义  26
  1.5 研究路线  26-28
第二章冰川土壤低温脂肪酶基因多样性研究  28-45
  2.1 实验材料  28-29
    2.1.1 材料  28
    2.1.2 菌株，载体，工具酶，试剂  28
    2.1.3 引物合成  28
    2.1.4 溶液  28
    2.1.5 培养基  28
    2.1.6 主要仪器  28-29
  2.2 研究方法  29-32
    2.2.1 冰川土壤微生物宏基因组DNA的提取和纯化  29
    2.2.2 低温脂肪酶简并引物设计  29-30
    2.2.3 冰川土壤脂肪酶基因片段的扩增  30-31
    2.2.4 低温脂肪酶基因片段文库的构建  31-32
    2.2.5 冰川土壤低温脂肪酶基因多样性分析  32
  2.3 结果与分析  32-44
    2.3.1 冰川土壤微生物宏基因组的提取和纯化  32-33
    2.3.2 低温脂肪酶简并引物设计  33
    2.3.3 低温脂肪酶基因片段的扩增  33-34
    2.3.4 低温脂肪酶基因片段文库的构建  34
    2.3.5 冰川土壤低温脂肪酶基因多样性的分析  34-44
  2.4 本章小结  44-45
第三章冰川土壤产低温脂肪酶微生物的筛选和脂肪酶基因克隆  45-73
  3.1 实验材料  45-47
    3.1.1 菌株，载体，工具酶，试剂  45
    3.1.2 引物合成  45-46
    3.1.3 溶液  46-47
    3.1.4 培养基  47
    3.1.5 主要仪器  47
  3.2 研究方法  47-57
    3.2.1 冰川土壤中低温脂肪酶产生菌的筛选  47-48
    3.2.2 脂肪酶活力测定方法  48-49
    3.2.3 产脂肪酶菌种基因组DNA的提取  49-50
    3.2.4 产脂肪酶菌种 16S/18S rDNA 的 PCR 扩增和鉴定  50-51
    3.2.5 低温脂肪酶基因片段的扩增和鉴定  51-52
    3.2.6 低温脂肪酶基因全长的克隆  52-56
    3.2.7 低温脂肪酶基因全长序列分析  56-57
    3.2.8 低温脂肪酶蛋白质三级结构预测  57
  3.3 结果与分析  57-72
    3.3.1 冰川土壤中低温脂肪酶产生菌的筛选  57
    3.3.2 产脂肪酶菌种基因组总DNA的提取  57
    3.3.3 产脂肪酶菌种 16S/18S rDNA 的 PCR 扩增和鉴定  57-59
    3.3.4 低温脂肪酶基因片段的扩增和序列分析  59-62
    3.3.5 低温脂肪酶基因全长的克隆  62-63
    3.3.6 低温脂肪酶基因序列的分析  63-70
    3.3.7 低温脂肪酶蛋白质三级结构的预测和分析  70-72
  3.4 本章小结  72-73
第四章低温脂肪酶的异源表达  73-88
  4.1 实验材料  73-74
    4.1.1 菌株，载体，工具酶，试剂  73
    4.1.2 引物合成  73
    4.1.3 溶液  73-74
    4.1.4 培养基  74
    4.1.5 仪器和试剂  74
  4.2 研究方法  74-83
    4.2.1 LipDB5 在大肠杆菌中的表达  74-78
    4.2.2 Lip3A和LipXD在毕赤酵母中的表达  78-83
  4.3 结果与分析  83-87
    4.3.1 LipDB5 在大肠杆菌中的表达  83-85
    4.3.2 lip3A和LipXD在毕赤酵母中的表达  85-87
  4.4 本章小结  87-88
第五章讨论  88-91
第六章全文结论  91-92
参考文献  92-102
致谢  102-103
作者简历  103

冰川土壤低温脂肪酶基因多样性研究及其基因克隆

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