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Complexin与SNARE复合体之间的相互作用及其功能的研究

作　者: 刘京国
导　师: 隋森芳
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: Complexin SNARE复合体相互作用递质释放
分类号: Q42
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Complexin是一个在快速神经递质释放过程中通过结合SNARE复合体发挥重要作用的高度亲水的小分子蛋白。但是关于complexin蛋白两侧区域在结合SNARE复合体时有何作用以及complexin蛋白在SNARE复合体形成过程中有什么作用目前还没有报道,此外,高浓度的complexin蛋白抑制递质释放的分子机理目前也不清楚。本文重点研究了complexin与SNARE复合体之间结合的特性以及高浓度的complexin抑制递质释放的分子机理。本文首先利用pull-down和荧光共振能量转移的方法分析complexin蛋白两侧区域对其结合SNARE复合体的影响。结果显示,complexin的71-77片断是其结合SNARE复合体所必需的;而且突变这个片断上的73、74、75位的带正电荷的赖氨酸能抑制complexin与SNARE复合体的结合能力,这说明complexin的71-77片断可能通过静电作用影响complexin与SNARE复合体之间的结合。其次,为了分析complexin在SNARE复合体形成过程中的作用,本文构建了一系列SNARE复合体的突变体来模拟不同组装程度的SNARE复合体的中间体。证明了complexin能与不同组装程度的SNARE复合体的中间体结合;而且complexin的结合能力与SNARE复合体的组装程度成正相关。这说明,complexin在SNARE复合体形成早期就开始结合SNARE复合体,随着SNARE复合体组装完成,complexin与其结合也就越紧密。论文第三部分构建并筛选了能稳定表达complexin的PC12细胞系,以此来研究complexin的功能。证明了在PC12细胞中过量表达complexin能抑制SNARE复合体的再循环,从而导致细胞中RRP囊泡的减少,最终反映在递质释放的减少。这表明,complexin除了公认的将囊泡停留在半融合状态外,还参与SNARE复合体的再循环。以上结果揭示了complexin如何结合SNARE复合体以及它在SNARE复合体的再循环过程中的作用,这有助于进一步理解complexin在递质释放过程中的作用。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-13
第1章引言  13-40
  1.1 神经元和突触囊泡  13-14
  1.2 突触囊泡的循环  14-17
  1.3 突触囊泡与突触前膜融合的机理-SNARE 假说  17
  1.4 参与囊泡融合的几种重要蛋白  17-38
    1.4.1 SNARE 蛋白组分及其结构和功能  18-26
      1.4.1.1 SNARE 蛋白的结构  19-22
      1.4.1.2 SNARE 复合体的形成和解聚  22-24
      1.4.1.3 SNARE 蛋白与膜  24-26
    1.4.2 Synaptotagmin 蛋白的结构和功能  26-28
      1.4.2.1 Synaptotagmin 的发现和结构  26-27
      1.4.2.2 Synaptotagmin 的功能  27-28
    1.4.3 nSec1/Munc18（SM 蛋白）的结构和功能  28-30
    1.4.4 Ra63 的结构和功能  30
    1.4.5 α-SNAP 和NSF 蛋白的结构和功能  30-33
    1.4.6 Complexin 蛋白的结构和功能  33-38
      1.4.6.1 Complexin 蛋白的发现及分布  33
      1.4.6.2 Complexin 蛋白结构特点  33-35
      1.4.6.3 Complexin 蛋白的功能特征  35-37
      1.4.6.4 与complexin 相关的疾病  37-38
  1.5 本文研究内容和意义  38-40
第2章 COMPLEXIN 上参与结合SNARE 复合体的新位点  40-58
  2.1 不同来源的COMPLEXIN氨基酸序列对比  40-41
    2.1.1 材料与方法  40
    2.1.2 结果  40-41
  2.2 不同突变体对COMPLEXIN 结合SNARE 复合体的影响  41-48
    2.2.1 实验材料  41-42
    2.2.2 实验方法  42-46
      2.2.2.1 构建质粒  42-44
      2.2.2.2 蛋白的表达和纯化  44-45
      2.2.2.3 SNARE 复合体的制备  45
      2.2.2.4 Pull-down 检测  45-46
    2.2.3 实验结果  46-48
      2.2.3.1 蛋白样品的制备  46
      2.2.3.2 不同complexin 或其突变体结合SNARE 复合体的分析  46-48
  2.3 突变73、74、75 位的赖氨酸对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响  48-55
    2.3.1 实验材料  48
    2.3.2 实验方法  48-51
      2.3.2.1 构建质粒  48-49
      2.3.2.2 蛋白的表达和纯化  49
      2.3.2.3 Pull-down 检测  49
      2.3.2.4 荧光共振能量转移  49-51
    2.3.3 实验结果  51-55
      2.3.3.1 突变CPXII 77 末端的三个保守的赖氨酸对CPXII 77 结合SNARE的影响  51-55
  2.4 N 端缺失对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响  55-56
    2.4.1 实验材料  55
    2.4.2 实验方法  55
    2.4.3 实验结果  55-56
  2.5 本章小结与讨论  56-58
第3章 COMPLEXIN 与不同组装程度的SNARE 复合体之间的结合  58-74
  3.1 制备一系列模拟处于部分组装的SNARE 复合体的突变体  58-64
    3.1.1 实验材料  58
    3.1.2 实验方法  58-60
      3.1.2.1 构建质粒  58-59
      3.1.2.2 蛋白的表达和纯化  59
      3.1.2.3 SNARE 复合体的突变体的制备  59
      3.1.2.4 SNARE 复合体的突变体在不同温度下的SDS 抗性分析  59-60
      3.1.2.5 圆二色光谱分析  60
    3.1.3 实验结果  60-64
      3.1.3.1 由SNAP-25 突变体组成的SNARE 复合体的突变体的制备  60-61
      3.1.3.2 SNARE 突变体的稳定性表征  61-64
  3.2 分析COMPLEXIN是否能与部分组装的SNARE 复合体结合  64-68
    3.2.1 实验材料  64
    3.2.2 实验方法  64-66
      3.2.2.1 质粒的构建  64
      3.2.2.2 蛋白的表达和纯化  64-65
      3.2.2.3 PC12 细胞的培养、转染以及细胞裂解液的提取  65
      3.2.2.4 Pull-down 检测  65-66
    3.2.3 实验结果  66-68
      3.2.3.1 Complexin 与部分组装的SNARE 复合体结合的分析  66
      3.2.3.2 Complexin 与部分组装SNARE 复合体的结合不受SNARE 蛋白的翻译后修饰影响  66-68
  3.3 COMPLEXIN 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位  68-70
    3.3.1 实验材料  68
    3.3.2 实验方法  68-69
      3.3.2.1 真核表达融合质粒的构建  68-69
      3.3.2.2 细胞培养和转染  69
      3.3.2.3 用共聚焦荧光显微镜观察蛋白的共定位  69
    3.3.3 实验结果  69-70
      3.3.3.1 Complexin 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位  69-70
  3.4 COMPLEXIN 与不同组装情度的SNARE 复合体结合能力的比较  70-73
    3.4.1 实验材料  70-71
    3.4.2 实验方法  71
      3.4.2.1 荧光共振能量转移  71
    3.4.3 实验结果  71-73
      3.4.3.1 Complexin 结合SNARE 复合体的能力与SNARE 复合体的组装程度成正相关  71-73
  3.5 本章小结与讨论  73-74
第4章过量表达COMPLEXIN 抑制递质释放的机理  74-93
  4.1 稳定表达COMPLEXIN的PC12 细胞系的建立  75-79
    4.1.1 实验材料  75
    4.1.2 实验方法  75-77
      4.1.2.1 真核表达质粒的构建  75
      4.1.2.2 PC12 细胞的培养和转染  75-76
      4.1.2.3 稳定表达complexin 的PC12 细胞系的筛选和鉴定  76
      4.1.2.4 检测在稳定表达细胞系中参与递质释放有关的蛋白的表达水平  76
      4.1.2.5 多克隆抗血清的制备  76-77
    4.1.3 实验结果  77-79
      4.1.3.1 稳定表达complexin 的PC12 细胞系的建立  77-78
      4.1.3.2 稳定表达complexin 对其他参与递质释放的蛋白表达水平的影响  78-79
  4.2 分析过量表达COMPLEXIN 对递质释放的影响  79-85
    4.2.1 实验材料  79-80
    4.2.2 实验方法  80-81
      4.2.2.1 [7,8,~3H]多巴胺释放的检测  80
      4.2.2.2 细胞中钙水平变化的检测  80-81
    4.2.3 实验结果  81-85
      4.2.3.1 Complexin 过量表达对递质释放的影响  81-84
      4.2.3.2 Complexin 过量表达对可释放囊泡库大小的影响  84-85
  4.3 过量表达COMPLEXIN对大致密囊泡的数目和分布的影响  85-89
    4.3.1 实验材料  85
    4.3.2 实验方法  85-88
      4.3.2.1 电镜切片的制备和观察  85-88
    4.3.3 实验结果  88-89
      4.3.3.1 过量表达complexin不影响PC12细胞中大致密囊泡的数目和分布  88-89
  4.4 过量表达COMPLEXIN对细胞中SNARE 复合体循环的影响  89-91
    4.4.1 实验材料  89-90
    4.4.2 实验方法  90
      4.4.2.1 细胞膜组分的制备  90
    4.4.3 实验结果  90-91
      4.4.3.1 过量表达complexin 导致PC12 细胞中SNARE 复合体的积累  90-91
  4.5 本章小结与讨论  91-93
第5章利用荧光共振能量转移来研究SYNAPTOTAGMIN 胞质部分（C_2AB)的聚集  93-109
  5.1 在体外用荧光共振能量转移来分析C_2AB 的聚合  93-103
    5.1.1 实验材料  93-94
    5.1.2 实验方法  94-96
      5.1.2.1 N 端融合CFP 或YFP 的C_2AB 真核表达质粒的构建  94
      5.1.2.2 T293 细胞的培养和转染  94-95
      5.1.2.3 转染后的细胞膜组分和上清组分的制备分离  95-96
      5.1.2.4 荧光共振能量转移的检测  96
      5.1.2.5 荧光数据的处理  96
    5.1.3 实验结果  96-103
      5.1.3.1 融合的CFP-YFP 能产生很强的FRET 信号  96-97
      5.1.3.2 C2AB 在有钙离子和膜存在的条件下能产生FRET 信号  97-101
      5.1.3.3 膜上胆固醇和PIP_2的含量能影响C_2AB 膜上的聚合  101-103
  5.2 在细胞水平上用荧光共振能量转移来研究C_2AB 的聚合  103-107
    5.2.1 实验材料  103
    5.2.2 实验方法  103-105
      5.2.2.1 细胞的培养和转染  103
      5.2.2.2 用荧光显微镜检测C_2AB 间的FRET  103-105
    5.2.3 实验结果  105-107
      5.2.3.1 CFP-YFP 融合蛋白在细胞中能产生很强的FRET 信号  105-106
      5.2.3.2 C_2AB 在细胞膜上能发生共振能量转移  106-107
  5.3 本章小结与讨论  107-109
第6章结论  109-112
  6.1 论文总结  109-110
  6.2 论文工作中的问题以及展望  110-112
参考文献  112-125
致谢  125-126
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  126

Complexin与SNARE复合体之间的相互作用及其功能的研究

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