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异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂的神经保护和促胚胎干细胞分化为神经细胞的研究
作 者: 王志强
导 师: 楼宜嘉
学 校: 浙江大学
专 业: 药理学
关键词: 异戊烯基黄酮 雌激素受体调节剂 雌激素受体 受体—配体对接 淫羊藿素 异补骨脂黄酮 阿尔兹海默病(AD) β淀粉样蛋白 神经保护 胚胎干细胞 神经细胞 定向分化
分类号: R96
类 型: 博士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
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雌激素受体调节剂 的学位论文">雌激素受体调节剂指能与雌激素受体结合,并产生受体激动和/或拮抗作用的配体化合物,可分为雌激素受体激动剂、拮抗剂和选择性调节剂（兼具两种活性）。雌二醇是活性最强的雌激素受体激动剂,对中枢神经系统发育和功能维护具有重要意义,选择性雌激素受体调节剂的生理活性具有组织和细胞特异性,并与体内雌激素水平有关,其在神经系统中的作用有待深入研究。淫羊藿（Herba Epimedii）是一味经典的补益中药,具有改善心脑血管系统功能、防治骨质疏松、增强机体免疫力及调节内分泌等功效。其主要有效成分淫羊藿苷（icaritin,ICA）为异戊烯基黄酮苷类化合物,淫羊藿素（icaritin,ICT）和去甲淫羊藿素（desicaritin,DICT）是ICA的体内代谢组分,也有少量存在于淫羊藿中。鉴于大豆黄素前体经脱糖基去甲基后所形成的苷元呈现雌激素样作用,本研究采用类似的结构修饰思路制备而得ICT和DICT。采用MCF-7/BOS细胞增殖试验（E-SCREEN法）检测此三个化合物是否具有雌激素样活性并对相关机制进行探索,在此基础上论文第二章拓宽了对异戊烯基黄酮类结构类似物的雌激素样活性构效关系研究。鉴于许多难治性复杂疾病如神经退行性改变等均与体内雌激素水平的异常相关,而雌二醇具有神经保护作用并在神经发育分化中发挥重要作用。本论文进一步探讨了异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂在神经保护和神经分化方面的可能活性和机制,旨在为此类植物来源的雌激素受体调节剂防治神经退行性改变的活性提供依据。第一章淫羊藿素及去甲淫羊藿素的雌激素样活性及机制研究为评价ICA、ICT和DICT的雌激素样活性并对机制进行探索,本研究采用E-SCREEN法和雌激素受体效应基因检测法相结合进行活性评价。实验采用MTT法检测细胞数量,流式细胞术分析细胞周期变化,RT-PCR法检测雌激素受体效应基因表达变化,并运用雌激素受体拮抗剂ICI 182,780作为工具药对雌激素受体依赖性进行评价。结果显示ICT、DICT可显著促进MCF-7/BOS增殖,呈现较强的雌激素样作用,而ICA则无此效应。细胞周期分析显示ICT和DICT促MCF-7/BOS增殖效应与S期细胞增加有关,该效应类似于雌二醇。此增殖效应在1 n mol/L-10 mol/L之间呈现量效关系,并可被雌激素受体完全阻断剂ICI182,780抑制。ICT和DICT处理24 h能显著增加雌激素效应基因PgR和pS2的表达,该效应也能被ICI 182,780所阻断。因此可推断ICT和DICT可视为两种新的植物来源雌激素受体调节剂,其雌激素样效应是经由雌激素受体介导的。第二章异戊烯基黄酮类衍生物雌激素样活性构效关系研究及机制探讨基于ICA、ICT和DICT由于取代基团不同带来的雌激素活性差异,本研究对系列异戊烯基结构类似物进行了进一步考察,采用生物活性评价和计算机辅助受体一配体对接实验（DOCKING）相结合的方法对异戊烯基黄酮类化合物的雌激素样活性构效关系进行了初步探索。结果表明,与ICT结构类似的异戊烯基黄酮类衍生物普遍具有雌激素样活性,但活性强弱有所不同,异补骨脂黄酮（isobavachin,IBA）活性最强,ICA无此活性,其雌激素样活性强弱排序如下:雌二醇＞IBA＞4’,5,7-三羟基-8-异戊烯基黄酮（4’,5,7-Dihydroxy-8-prenylflavone）＞4’,7—二羟基-8-异戊烯基黄酮（4’,7-Dihydroxy-8-prenylflavone）＞DICT＞ICT＞＞ICA（无活性）。周期分析和雌激素受体效应基因、蛋白检测结果显示,异戊烯基黄酮类化合物能够上调雌激素效应基因和蛋白pS2、PgR的表达,通过增加G1/S期细胞比例来促进细胞增殖,这些效应均可被雌激素受体抑制剂ICI182,780所抑制,表明了其雌激素受体依赖性的特点。DOCKING结果表明该类化合物的活性强弱与其和雌激素受体的亲和力一致,ICA由于巨大的空间位阻作用不易与雌激素受体结合而不具备活性。该类化合物由于取代基及分子极性不同而表现活性强弱差异,异戊烯基是此类化合物的重要结构特征之一。该部分研究表明异戊烯基黄酮类化合物普遍具有较强的雌激素样活性,并解释了此类化合物的部分构效关系。第三章异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂淫羊藿素对Aβ肽所致大鼠原代培养神经元损伤的保护作用近年来,雌激素在防治神经退行性改变中的作用受到极大关注,但对其治疗地位和作用机理尚存在较大争议,雌激素对阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）的治疗地位与价值也远未阐明亟待获得肯定。鉴于雌二醇对神经系统的保护作用,本研究对异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂在AD防治中的潜在价值及其机制进行了初步探索。由于淀粉样蛋白所致神经损伤是AD的重要病理基础之一,Aβ25-35则是β淀粉样蛋白的毒性片断,本实验采用Aβ25-35致原代培养大鼠胚胎神经细胞毒性损伤模型,用以评价异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂的神经保护作用并对机制进行研究。实验采用免疫荧光法鉴定原代培养神经细胞,倒置显微镜观察评价细胞形态学变化,MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放量检测评价细胞生存状况,AO/EB染色用于初步评价细胞凋亡情况,JC-1染色法评价细胞膜电位的变化,WesternBlot法检测相关蛋白表达变化。结果表明,ICT能够浓度依赖性地抵抗Aβ25-35所致的神经细胞毒性损伤,表现为细胞生存率升高,培养基中LDH释放减少,神经元染色质固缩减少。该过程与神经细胞线粒体跨膜电位（△Ψm）改变及Bcl-2家族蛋白表达变化有关。ICT能抵抗Aβ25-35所致神经细胞△Ψm损失,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而发挥神经保护作用。该活性能被雌激素受体拮抗剂ICI182,780部分拮抗,表明该作用是雌激素受体依赖性的;ERK-MAPK抑制剂PD98059也能部分拮抗ICT的神经保护作用,表明ERK-MAPK通路也参与了该神经保护过程。第四章异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂淫羊藿素对小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞的诱导作用AD是以神经元损伤丢失为特征的难治性神经退行性疾病,细胞移植治疗是未来的治疗前景之一。目前,胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）体外定向分化为神经细胞的潜能用于退行性改变的细胞替代治疗,及药物介入细胞替代治疗的前景已引起关注。主要研究进展集中在简化诱导步骤,缩短诱导时间及控制神经细胞发生途径接近体内神经细胞发生过程等方面。与此同时,部分研究表明,某些小分子药物可通过调节ES细胞微环境控制其分化命运,为ES细胞的定向分化开辟了新思路。上述研究结果提示,ICT可经由雌激素受体和ERK-MAPK通路保护原代培养胎鼠神经细胞免受损伤,提示发育中神经细胞可能存在ICT作用环节。而且有研究表明,某些小分子药物可通过调节ES细胞微环境控制其分化命运。本实验利用小鼠ES细胞体外定向分化为神经细胞的模型,旨在探索异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂对ES细胞分化神经细胞潜在的促进作用,并对分化过程中的生物信息变化和分化机制作初步研究。实验采用维甲酸（Retinoic acid,RA）作为阳性药,采用4- 4+拟胚体分化法构建ES细胞分化模型,用细胞形态学观察和免疫细胞化学标记的方法评价ES细胞分化为神经细胞过程中的形态学变化,用流式细胞仪检测药物诱导下神经前体细胞标志蛋nestin和神经元标志蛋白β-TublinⅢ阳性表达细胞情况,采用RT-PCR和Western Blot法检测ES细胞分化过程中基因和蛋白表达的变化。结果显示ICT（0.01～1μmol/L）和RA（0.1μmol/L）能促进ES细胞分化为神经细胞,显著增加ES细胞分化而来的前体细胞（d 9+0）和成熟神经元细胞（d 8+10）数量。RT-PCR法检测发育标志基因结果显示,ICT和RA能增加ES细胞发育过程中中胚层和外胚层发育基因Fgf、Branchy的表达,并延长表达时相。Western Blot结果显示,神经标志蛋白β-TublinⅢ和胆碱能神经标志蛋白（胆碱乙酰基转移酶,ChAT）在分化后期（d8+0开始）表达不断增加。d 8+5和d 8+10,RA和ICT处理组β-TublinⅢ、ChAT蛋白表达显著增加,提示RA和ICT具有促进ES细胞分化为神经细胞的作用,并且分化的细胞中包含胆碱能神经。分化机制初步探索结果显示,ICT组和RA组p38磷酸化水平较溶剂对照组低,而ERK磷酸化水平略为偏高。鉴于p38在ES细胞定向分化过程的分子开关作用,本实验结果提示ICT可能是通过抑制p38蛋白磷酸化的途径促进ES细胞分化为神经细胞。为论证异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂上述促分化共性作用,进一步对IBA进行了促定向分化作用检测。结果显示,其促ES细胞定向分化神经细胞作用与ICT相近似,而ICA则无明显的活性,表明具有雌激素样活性的异戊烯基黄酮可能具有此类促分化共性作用,该活性与雌激素受体调节作用呈相关性。第五章生物活性导向法分离中药补骨脂中异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂前述实验表明,IBA具有较强的雌激素样活性。鉴于ICT来源于补益中药淫羊藿,IBA也是补益中药补骨脂的化学成分之一,本研究采用E-SCREEN生物活性导向法分离补骨脂的异戊烯基黄酮类雌激素样活性组分,旨在为进一步作构效关系研究提供化合物来源。本研究采用醇提法获取补骨脂药材粗提品,以液液萃取、柱层析分离、HPLC分析、LC-MS、NMR结构解析为主要方法,以E-SCREEN法评价各层次组分雌激素样活性（生物活性导向）进行逐步分离。最终得4个雌激素活性化合物,其中三个为异戊烯基黄酮类化合物,分别为异补骨脂查尔酮（isobavachalcone）、新异补骨脂黄酮（neobavaisoflavone）和8-异戊烯基大豆素（8-prenyldaidzein）。本研究工作为补益中药药效物质基础后续研究提供了重要线索。结论1、ICT、DICT和IBA等异戊烯基黄酮类化合物具有雌激素样作用,该作用经由雌激素受体介导,通过调控雌激素受体效应基因蛋白表达和调节细胞周期发挥作用,是一类新型结构的植物来源雌激素受体调节剂。2、异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂构效关系具有以下特点:异戊烯基是此类化合物的重要共性特征之一;取代基位置和疏水性强弱可影响其内在活性;与雌激素受体的亲和力大小是影响其活性强弱的主要因素之一,分子中糖基取代可影响受体—配体亲和力而使其丧失活性。3、ICT具有抗Aβ25-35所致原代培养神经细胞损伤的作用,该作用能被雌激素受体拮抗剂ICI 182,780和ERK-MAPK激酶抑制剂PD 98059部分阻断。表明该保护作用是通过雌激素受体介导,并与ICT上调Bcl-2蛋白,阻断线粒体凋亡通路有关。4、ICT和IBA具有诱导小鼠ES细胞体外定向分化为神经细胞（含ChAT阳性表达细胞）的作用,是一类有前景的分化诱导剂;该类异戊烯基黄酮雌激素受体调节剂的促分化作用与雌激素样活性有关,但并不完全通过ER依赖性途径发挥作用,ICT引起的p38低磷酸化水平可能是此类化合物促分化的重要因素。5、同属补益中药的淫羊藿与补骨脂中,含有多种具有雌激素样作用异戊烯基黄酮类,推测补益中药中所含雌激素样活性成分是其相关药效的重要物质基础之一。
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全文目录
中文摘要 7-12
英文摘要 12-19
论文创新点和研究意义 19-20
前言 20-22
第一章 淫羊藿素及去甲淫羊藿素雌激素样活性及作用机制研究 22-36
引言 22-23
一、实验仪器与材料 23-24
二、实验方法 24-28
(一)MCF-7细胞常规培养 24
(二)去激素血清的制备 24-25
(三)E-SCREEN法检测雌激素样活性 25
(四)雌激素受体完全拮抗剂对药物促增殖作用的拮抗作用 25
(五)流式细胞术检测MCF-7细胞周期的变化 25-26
(六)RT-PCR检测雌激素效应基因表达水平的变化 26-28
三、实验结果 28-34
(一)淫羊藿素和去甲淫羊藿素对MCF-7细胞的促增殖作用 28-29
(二)ICI182,780对ICT及DICT促MCF-7细胞促增殖活性的阻断作用 29-31
(三)淫羊藿素和去甲淫羊藿素对MCF-7细胞周期的影响 31-32
(四)淫羊藿素和去甲淫羊藿素对雌激素效应基因表达的影响 32-34
四、讨论 34-36
第二章 异戊烯基黄酮类衍生物雌激素样活性构效关系研究及机制探讨 36-47
引言 36
一、实验材料 36
二、实验方法 36-37
(一)细胞增殖测定、细胞周期分析、基因表达检测方法同第一部分 36
(二)Western Blot检测PgR蛋白 36-37
(三)计算机辅助构效关系研究 37
三、实验结果 37-44
(一)淫羊藿素衍生物雌激素样活性及ICI 182,780的拮抗作用 37-41
(二)异补骨脂黄酮对MCF-7细胞周期的影响 41
(三)异补骨脂黄酮对MCF-7细胞雌激素效应基因和蛋白表达的影响 41
(四)受体配体对接实验结果 41-44
四、讨论 44-46
五、小结 46-47
第三章 异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂对β淀粉样蛋白所致原代培养神经元损伤的保护作用 47-66
引言 47
一、实验材料 47-49
二、实验方法 49-52
(一)原代大鼠皮层神经元的培养 49-50
(二)免疫细胞化学法鉴定原代培养神经细胞 50
(三)组别设置和药物处理 50
(四)细胞活力测定 50-51
(五)细胞形态观察和突触评价 51
(六)AO/EB染色法检测细胞凋亡 51
(七)JC-1染色法检测细胞膜电位水平 51
(八)Western Blot检测蛋白表达变化 51-52
(九)分子对接法模拟配体受体亲和力 52
(十)统计学处理 52
三、实验结果 52-61
(一)原代培养大鼠皮层神经元细胞的形态和鉴定 52-53
(二)Aβ_(25-35)致神经细胞损伤模型的构建 53
(三)淫羊藿素对Aβ_(25-35)致损伤模型中神经细胞的活力影响 53-55
(四)淫羊藿素对Aβ_(25-35)致损伤模型中神经细胞的细胞形态学变化 55-57
(五)淫羊藿素对Aβ_(25-35)致损伤模型中神经细胞的抗凋亡作用 57
(六)淫羊藿素对Aβ_(25-35)致损伤模型中凋亡相关蛋白表达的影响 57
(七)ICI 182,780和PD 98059对淫羊藿素神经保护作用的阻断作用 57-59
(八)受体配体对接实验 59-61
四、讨论 61-65
五、小结 65-66
第四章 异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂对胚胎干细胞分化为神经细胞的诱导作用 66-89
前言 66
一、实验仪器与材料 66-67
二、实验方法 67-72
(一)ES细胞常规培养 67-68
1.原代小鼠胚胎成纤维细胞制备 67-68
2.饲养层细胞制备 68
3.ES细胞支持培养 68
(二)药物诱导ES细胞体外定向分化为神经细胞培养 68-69
(三)药物诱导ES细胞分化过程中的生物信息和分化机制研究 69-72
1.RT-PCR法检测神经分化过程中基因表达 69-71
2.免疫荧光法检测神经特异性蛋白和发育相关蛋白表达 71-72
3.流式细胞术定量检测标志蛋白阳性细胞 72
4.WesternBlot检测蛋白表达变化 72
三、实验结果 72-85
(一)MEF细胞、ES细胞及不同分化阶段的细胞形态观察 72-73
(二)淫羊藿素对ES细胞体外定向分化为神经细胞的促进作用 73-81
(三)淫羊藿素诱导ES细胞分化为神经细胞过程生物信息变化 81-83
1.分化过程中发育依赖性基因的表达变化 81-82
2.分化过程中神经特异性蛋白表达的变化 82
3.分化过程中ERK-MAPK,p38-MAPK通路蛋白表达的变化 82-83
(四)淫羊藿素诱导胚胎干细胞分化为胆碱神经的免疫鉴定 83
(五)淫羊藿苷和异补骨脂黄酮对ES细胞分化为神经细胞的影响 83-85
四、讨论 85-88
五、小结 88-89
第五章 生物活性导向法分离补益中药补骨脂中异戊烯基黄酮类雌激素受体调节剂 89-100
引言 89
一、实验材料 89-90
二、实验方法 90
(一)粗提物制备 90
(二)成分分离 90
(三)组分活性评价 90
三、实验结果 90-91
四、讨论 91-94
五、小结 94-96
六、附录:生物导向分离得到的雌激素样活性化合物结构鉴定数据及结构式 96-100
参考文献 100-108
综述 雌激素受体调节剂及其在神经保护和发育中的药理活性研究进展 108-127
附录 博士在读期间所获科研成果情况 127-129
致谢 129
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