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缺氧诱导因子1α在食管鳞癌发病机制中的研究

作　者: 施瑞华
导　师: 范钦和
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理学
关键词: 食管鳞癌缺氧诱导因子血管内皮生长因子微血管密度 RNA干扰短发夹状RNA 血管生成原位杂交免疫组织化学
分类号: R735.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景：缺氧诱导因子是一类由异源二聚体组成的转录因子，在机体对缺氧适应性调节中发挥关键作用。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是其亚型之一，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内，介导缺氧反应基因(HRG)的调控，产生生理效应。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)为HIF-1的氧调节亚单位，是其活性调节中心。研究发现HIF-1α在大多数恶性肿瘤中存在表达，可通过调节血管内皮生长因子(VEGF)等表达诱导血管生成，参与肿瘤发生和发展。目的1、观察HIF-1α、VEGF在食管癌患者发生、发展不同阶段中表达变化及其与微血管密度(MVD)和肿瘤临床病理特征间的相关性。2、观察缺氧状态下HIF-1α、VEGF在食管鳞癌细胞系Eca-109中的表达变化。3、观察HIF-1α基因表达调控对食管鳞癌细胞生物学行为的影响。4、通过裸鼠移植瘤实验，探讨HIF-1α基因表达调控对食管鳞癌生长、侵袭等行为的影响。方法1、采用免疫组化和原位杂交方法检测42例食管正常上皮、40例食管鳞状上皮不典型增生和67例食管鳞癌组织中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达，分析在食管鳞癌发生、发展不同阶段HIF-1α、VEGF表达变化；以CD31作为微血管密度(MVD)指标，分析(1)HIF-1α、VEGF表达与MVD的相关性；(2)HIF-1α、VEGF和MVD与肿瘤临床病理特征的相关性。2、在正常氧分压和低氧条件下Eca-109细胞传代培养，采用RT-PCR和Western-Blot方法检测HIF-1αmRNA和蛋白表达变化。3、利用RNA干扰技术构建重组质粒pGCsi-H1-shHIF转染Eca-109细胞：(1)通过RT-PCR及Western Blot观察HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞株中HIF-1α、VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN表达；(2)流式细胞仪分析HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞生长变化；(3)细胞增殖实验观察其增殖活力改变。4、HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞株和普通Eca-109细胞株植入裸鼠体内，对比观察移植瘤生长情况。结果1、在食管正常鳞状上皮-不典型增生上皮-鳞癌组织中HIF-1α、VEGF在mRNA和蛋白水平表达呈逐步升高趋势，MVD值显著增加，组间差异明显；鳞癌组织HIF-1α蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关，且HIF-1α、VEGF蛋白表达与MVD值呈正相关；鳞癌中HIF-1α、VEGF蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期正相关。2、Eca-109细胞中HIF-1αmRNA水平在缺氧组较正常氧组明显升高；VEGF mRNA的表达水平与HIF-1αmRNA表达一致；HIF-1α蛋白水平在缺氧状态下与正常氧状态下相比无显著差异。无论在正常氧还是缺氧状态下HIF-1α蛋白的表达均存在磷酸化及去磷酸化两种形式。3、pGCsi-H1-shHIF成功转染Eca-109细胞，有效抑制HIF-1α基因表达并稳定传代；伴随HIF-10α基因沉默同时出现VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN的蛋白表达均下降；HIF-1α基因沉默后Eca-109更多阻滞于G1／G0期，且细胞增殖活力较对照组明显低下。4、HIF-1α基因沉默Eca-109细胞裸鼠移植瘤生长较普通传代Eca-109细胞移植瘤明显缓慢，移植瘤中心出现明显坏死，免疫组化提示移植瘤内HIF-1α、VEGF、MVD显著减少。结论1、食管鳞癌发生过程中HIF-1α、VEGF表达和MVD增加，HIF-1α可能通过诱导VEGF表达、促进肿瘤血管生成而在食管鳞癌发生发展中发挥重要作用；食管鳞癌中HIF-1α、VEGF高表达，提示两者有可能成为评价肿瘤恶性程度的指标。2、缺氧状态下HIF-1α在食管鳞癌细胞Eca-109中有过表达，主要表现在转录水平，同时伴有VEGF mRNA的表达增加。而缺氧时HIF-1α蛋白的表达水平虽然有升高，但无统计学意义，HIF-1α蛋白在缺氧状态下的调节机制可能发生在翻译后修饰水平。3、重组质粒pGCsi-H1-shHIF转染Eca-109细胞后能有效抑制其HIF-1α基因的表达，导致Eca-109细胞增殖活力下降，多被阻滞于G1／G0期，提示HIF-1α可影响肿瘤细胞DNA的复制合成。HIF-1α上游基因PTEN在HIF-1α基因表达受抑后也出现了一定程度的抑制，这表明在调控通路中HIF-1α对PTEN可能存在反馈调节机制。4、裸鼠移植瘤实验证实抑制HIF-1α表达后，瘤体生长减慢，提示HIF-1α在体内肿瘤生长过程中发挥重要作用，且可能通过抑制VEGF介导的肿瘤的生长与浸润。

全文目录

目录  2-4
本文所用主要缩略语  4-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-15
引言  15-17
第一部分食管鳞癌发生发展过程中HIF-1α表达变化及其与血管生成及肿瘤临床病理特点的关系  17-43
  材料  17-19
  方法  19-23
  结果  23-36
  分析与讨论  36-40
  结论  40
  参考文献  40-43
第二部分缺氧诱导因子-1α在食管鳞癌细胞株Eca-109中的表达及其意义  43-63
  材料  43-45
  方法  45-53
  结果  53-58
  讨论  58-60
  结论  60-61
  参考文献  61-63
第三部分缺氧诱导因子-1α基因沉默食管鳞癌细胞株的构建及HIF-1α基因调控对食管鳞癌细胞功能的影响  63-105
  材料  63-66
  方法  66-88
    食管鳞癌细胞株Eca-109 RNA干扰效应的观察  66-73
    Eca-109细胞中特异性抑制缺氧诱导因子-1α RNA干扰体系的建立  73-82
    缺氧诱导因子-1α基因沉默食管鳞癌细胞株的构建  82-87
    缺氧诱导因子-1α基因在食管鳞癌细胞中功能初步研究  87-88
  结果  88-94
  讨论  94-102
  结论  102-103
  参考文献  103-105
第四部分 RNA干扰对食管鳞癌细胞缺氧诱导因子-1α抑制效果的体内研究  105-114
  材料  105
  方法  105-107
  结果  107-111
  讨论  111-112
  结论  112-113
  参考文献  113-114
小结  114-115
综述  115-124
致谢  124-125

缺氧诱导因子1α在食管鳞癌发病机制中的研究

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