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青藤碱治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的药效学研究及机制探讨

作　者: 曾彦英
导　师: 丁新生；季晓辉
学　校: 南京医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 青藤碱 实验性自身免疫性脑脊髓炎 多发性硬化 神经功能评分 干扰素-γ 肿瘤坏死因子-α 趋化因子 T-box express in T cell(T-bet)
分类号: R277.7
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


背景多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。临床主要表现为复发缓解及进行性加重的神经功能障碍，是中青年人群致残的原因之一。目前MS尚无理想的治疗方法。青藤碱（Sinomenine，SIN）是中药青风藤的有效提取成份，具有明确的化学结构，临床上已应用于类风湿性关节炎的治疗，具有抗炎、免疫抑制等作用。MS具有与类风湿性关节炎相似的T细胞介导的免疫异常，而且免疫球蛋白和抗类风湿药（TK603）治疗MS和类风湿性关节炎具有肯定的疗效，其机制在于抑制自身反应性T细胞增殖活化，减轻组织炎症。有鉴于此，我们推测抗类风湿药物SIN有可能用于治疗MS。目的建立MS的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE），从神经功能评分、组织病理学、特异性T细胞增殖及其炎性细胞因子的反应、脊髓组织中炎性细胞因子、诱导型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS）及趋化因子的表达等方面进行评价，其中趋化因子包括单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）及活化调控的正常T细胞表达和分泌因子（regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES），以探讨SIN对MS的治疗作用，并初步探讨其机制。鉴于前期实验已证实SIN治疗EAE的作用与其抑制脾细胞的增殖及分泌干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）有关，而转录因子T-box express in T cell（T-bet）通过诱导辅助性T细胞1型（helper T Cell 1，Th1）分化及促进IFN-γ的分泌在EAE的进展中起关键作用。因此我们围绕SIN对T-bet表达的影响进一步探讨SIN对EAE干预作用的可能的分子机制。方法1．采用髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）肽段68-82(MBP68-82)免疫诱导Lewis大鼠，建立急性EAE模型。观察每日平均临床评分（mean clinical score）、发病率（incidence）、平均起病天数（mean day of onset）、疾病指数（disease index）及严重度均值（mean maximum severity）。此外，动物的体重变化也作为评价EAE严重度的指标。以苏木素-伊红（HE）和Luxol fast blue／periodic acid-Schiff（LFB／PAS）染色进行EAE大鼠脊髓组织病理学检查。2．探讨SIN对EAE发作的治疗作用，本实验分为5组：①模型对照组（Control组）：未给予抗原免疫，仅给予相同体积的溶剂0.2％DMSO；②模型组（EAE组）：抗原免疫EAE组，而后仅给予相同体积的溶剂0.2％DMSO；③SIN高剂量组（SIN200）：给予SIN200mg／kg／d的EAE组；④SIN中剂量组（SIN100）：给予SIN100mg／kg／d的EAE组；⑤SIN低剂量组（SIN50）：给予SIN50mg／kg／d的EAE组。从免疫的第-1天至第3天连续5天腹腔注射不同剂量的SIN治疗EAE大鼠，观察21天并进行临床评价；HE染色评价各组动物脊髓单个核细胞的浸润程度；分离各组大鼠脾细胞，测定其对抗原刺激反应的增殖反应和细胞因子分泌反应；ELISA法检测各组动物脊髓组织细胞因子的水平；免疫印迹法（western blot）检测各组动物脊髓组织iNOS的表达；RT-PCR检测各组动物脊髓组织趋化因子mRNA的表达；高效液相色谱法（high performance liquid phase，HPLC）检测各组动物SIN的血浆药物浓度。3．探讨SIN对诱导条件下脾细胞T-bet表达的作用，实验分3组：①Control组：正常的Lewis大鼠脾细胞；②诱导组：诱导的Lewis大鼠脾细胞；③干预组：SIN干预诱导的Lewis大鼠脾细胞。诱导条件：抗CD3抗体刺激Lewis大鼠脾细胞活化，IL-12诱导T细胞分化。RT-PCR检测T-bet mRNA在诱导培养脾细胞的表达时间及强度，并测定SIN对T-bet的影响，同时以ELISA法并行检测SIN对脾细胞培养上清IFN-γ的浓度。结果1．建立的急性EAE模型，其发病率为20／20；起病时间为（6.5±1.2）天：疾病指数为（1.9±0.4）；严重度评分（4.6±0.4）；体重改变（免疫后体重／免疫前体重）为（70.4±5.0）％。HE染色显示：脊髓组织内有单个核细胞浸润，血管周围炎性浸润明显，多数血管周围的浸润呈“袖套样”改变。模型大鼠脊髓组织的单位面积下血管周围淋巴细胞数为（43.4±9.0）个／mm3，明显高于对照组大鼠的（7.1±5.5）个／mm3（P＜0.01）。2．SIN对EAE的治疗作用（1）临床评价方面：与EAE组相比，SIN200明显降低EAE的发病率（15／20：20／20，P＜0.05）；SIN200及SIN100明显延长EAE的起病时间，分别为[（8.8±1.4）及（7.5±1.8）：（6.5±1.2），P＜0.05]天；SIN200、SIN100及SIN50降低疾病指数，分别为[（0.9±0.6）、（0.6±0.3）及（0.5±0.2）：（1.9±0.4），P＜0.05]；SIN200及SIN100降低疾病严重度，分别为[（3.4±0.4）及（2.8±0.3）：（4.6±0.4），P＜0.05]；同时，SIN200、SIN100及SIN50抑制EAE引起的体重减少，其体重改变的百分比，分别为[（84.5±5.0）、（81.2±5.2）及（73.4±4.8）：（70.4±5.0），P＜0.01]。（2）组织病理学（HE染色）方面：SIN各组脊髓灰白质淋巴细胞浸润及血管周围炎性细胞浸润随剂量依赖性减轻。与EAE组相比，SIN200、SIN100及SIN50各组淋巴细胞计数分别为[（12.5±7.0）、（18.5±5.5）及（25.5±8.5）：（43.4±9.0），P＜0.05]。（3）在对抗原刺激的反应性测定方面1)与EAE组比较，无论是非特异性刺激（PHA）还是特异性刺激(MBP68-82)，SIN各剂量组对EAE大鼠脾细胞增殖均有抑制作用（P＜0.05）。而各组对增殖的抑制作用呈剂量依赖性增强。与脾细胞增殖反应一致，SIN剂量依赖性地抑制特异性和非特异性刺激的EAE脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α分泌（P＜0.05）。2)将SIN各剂量组的脾细胞增殖及细胞因子与未干预的组（EAE组）进行比较，取得SIN各组抑制率，再进一步比较SIN干预对非特异性刺激（PHA）和特异性刺激(MBP68-82)反应的抑制率差异。结果显示：①在抑制脾细胞增殖方面，各剂量组SIN对MBP68-82刺激的增殖的抑制比对PHA刺激的更明显（P均＜0.05）。②抑制IFN-γ分泌方面，SIN200及SIN100对MBP68-82刺激的IFN-γ分泌抑制作用更明显（P均＜0.05）。③抑制TNF-α分泌方面，SIN各剂量组对PHA刺激的TNF-α分泌的抑制更明显（P均＜0.05）。（4）在对脊髓组织中炎症介质表达的影响方面1)与EAE组比较，SIN干预对EAE脊髓组织中的IFN-γ和TNF-α分泌具有抑制作用，且这种作用呈剂量依赖性增强（P＜0.05）。2)与EAE组比较，SIN50、SIN100及SIN200降低脊髓组织中iNOS的表达，分别为[（1.22±0.19）、（0.84±0.17）及（0.6±0.09）：（1.58±0.23），P＜0.05]。3)与EAE组比较，SIN干预对EAE脊髓组织中的趋化因子RANTES，MCP-1和MIP-1α的表达具有抑制作用，且这种作用呈一定程度的剂量依赖性（P＜0.05）。3．根据HPLC的结果，SIN给药剂量越高（200mg／kg．d、100mg／kg．d和50mg／kg．d），受药动物半衰期血浆浓度也随之增高（P＜0.05）。SIN100剂量下的血药浓度与疾病严重度指数和体重改变具有相关性，相关系数分别为[-0.6227（P＜0.05）和-0.7198（P＜0.01）]。4．体外诱导培养Lewis大鼠脾细胞，T-bet在12h，24h及48h均有表达，而12h的表达强度最高，此后逐渐衰减（P＜0.05）。SIN（1mM）预处理体外诱导培养Lewis大鼠脾细胞，12h后RT-PCR检测T-bet的表达，ELISA检测IFN-γ，结果发现，SIN能抑制T-bet的mRNA表达，同时伴有IFN-γ的分泌下降（P均＜0.01）。结论1．以MBP肽段68-82免疫，诱导Lewis大鼠建立了急性EAE模型，该模型的发病率、发病时间、病情发展规律及严重度与国外的报道一致，其病理学改变为脊髓内，尤其是血管周围的单个核细胞浸润性炎症。2．SIN抑制抗原特异性T细胞的活化和增殖，减少炎性因子分泌，减轻特异性T细胞介导的对髓鞘的免疫攻击，抑制脊髓内炎性因子和趋化因子的表达，从而减轻发作、改善临床症状、发挥对EAE的治疗作用。3．体外诱导培养体系中，SIN预处理的脾细胞IFN-γ分泌减少，其原因可能与SIN抑制Th1转录因子T-bet的表达有关。

全文目录


缩略语中英文对照  3-5
中文摘要  5-12
ABSTRACT  12-18
引言  18-23
第一部分 EAE模型的建立  23-37
  1.背景  23-25
  2.材料和方法  25-28
  3.结果  28-35
  4.讨论  35-37
第二部分 SIN治疗EAE的实验研究  37-75
  1.背景  37-40
  2.材料和方法  40-57
  3.结果  57-71
  4.讨论  71-75
第三部分 SIN对转录因子T-BET表达的抑制作用  75-83
  1.背景  75
  2.材料和方法  75-79
  3.结果  79-81
  4.讨论  81-83
全文小结  83-84
参考文献  84-94
附录  94-135
致谢  135-137
综述  137-151

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中医其他学科 > 中医神经病学与精神病学
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