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斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的性质及该菌检测方法的建立研究

作　者: 黄小丽
导　师: 汪开毓
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 斑点叉尾鮰 嗜麦芽寡养单胞菌 胞外蛋白酶 化学修饰 致病性 PCR诊断 原位PCR 病理学
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


斑点叉尾鮰肠套叠症（Infectious intussusception of channel catfish，IICC）是近年来在生产上出现的一种急性致死性斑点叉尾鮰的细菌性传染病，该病具有发病突然，死亡率高，传染快等特点，以体表出现圆形、椭圆形或不规则的褪色斑、腹水、肠炎以及后肠的肠套叠为病变特征，给我国斑点叉尾鮰养殖带来严重的经济损失。本研究对引起该病的病原嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）产生的胞外蛋白酶（Extracellular protease，ECPase）进行分离、提纯、特性分析、化学修饰及致病性研究，检测该酶是否为S．maltophilia的主要致病因子，通过病理学及超微病理学技术，研究了胞外蛋白酶的主要致病过程。另建立了该病的PCR诊断方法和原位PCR诊断方法，为科学有效的检测该菌及对疾病的诊断和监控奠定了理论基础和有效途径。以胰酪胨大豆肉汤（TSB）为基础培养基，测定不同碳源、氮源、培养温度和培养基初始pH值对嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶产酶量的影响，用以确定该菌的最佳产酶条件。结果表明，ECPase的产量与培养基内所含碳源、氮源、培养基初始pH值及培养时间等有很大关系，其最佳产酶条件为：以蔗糖作为碳源，酵母浸膏作为氮源，培养基初始pH值为7.0，在20℃温度下120r／min振荡培养72小时，嗜麦芽寡养单胞菌可产生最大量的ECPase。采用硫酸铵盐析，DEAE Sephadex A-50凝胶层析等方法从嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物中提纯了一种分子量为45.7KDa的单一多肽蛋白酶，该酶的最适温度为20℃，热稳定性差，100℃作用15min酶活完全丧失，最适pH为9.0，部分金属离子如Ca2+、Hg2+、Cu2+能使酶活性明显下降，而Co2+对酶有一定程度的激活作用，PMSF对酶活无明显影响而EDZA能显著降低酶活，证明该酶为一种碱性金属蛋白酶。同时利用PMSF、PCMB、N-AI、Ch-T、NBS、2-ME等6种化学修饰剂对嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶进行化学修饰，研究酶分子中哪些氨基酸侧链基团是表现酶活性所必需。结果表明Ch-T、NBS和2-ME能显著抑制酶活性，而N-AI、PMSF和PCMB对酶活的影响不大，说明蛋氨酸残基、色氨酸残基和二硫键是酶活性的必需基团，而酪氨酸残基、丝氨酸残基和巯基与酶活性无直接关系。同时检测了EDTA对酶活的影响，实验结果证实，EDTA能显著影响酶活性，证实该酶为一种金属蛋白酶。将提纯的蛋白酶腹腔注射小鼠，小鼠出现不同程度的死亡，其LD50为4.33μg／g体重。死亡鼠出现严重胃肠道炎，胃严重胀气，胃壁变得极度菲薄，肠胀气，肠壁变薄，内有淡黄色粘液；脾严重肿大、出血；肝脏极度肿大、出血。镜下可见肠粘膜坏死脱落；心肌细胞严重颗粒变性；肝脏细胞肿大，变性，坏死：脾严重出血，脾白髓区充满大量红细胞。将提纯的胞外蛋白酶腹腔注射健康斑点叉尾鮰后也出现不同程度死亡现象，其LD50为3.49μg／g。病鱼鳃丝肿胀；肝脏及肾脏肿大，质地脆，有大小不等的坏死区，肝细胞肿胀，严重空泡变性，大量细胞溶解消失，出现不同程度的溶解性坏死现象；肾小管上皮细胞严重空泡变性，细胞淡染，逐渐溶解，消失，隐约可见细胞轮廓；脾脏稍肿大，严重出血；有轻微肠炎，但未见临床上广泛出现的肠套叠现象。同时将提纯的蛋白酶做倍比稀释后接种96孔板培养的Vero细胞，发现该酶对Vero细胞具有明显细胞毒性，细胞明显变圆、坏死，脱落，在培养孔内出现明显空斑。以16SrDNA基因为靶序列，通过与其他细菌相关基因进行比对，设计一对特异性引物，用以扩增相应的特异性片段，结果表明，对所得的嗜麦芽寡养单胞菌标准株进行扩增，得到一428bp大小的单一DNA片段。同时对PCR反应条件进行优化，当50μl反应体系中加入4pmol的引物、10pmol的dNTP、150pmol的MgCI2、3.33U的Taq酶，以50℃为退火温度，延伸温度为72℃，延伸时间10min，25个循环后可以检测到144.6ng的DNA模板，PCR扩增效果较好。引物特异性强，与其他假单胞菌属、气单胞菌属细菌无交叉反应，可用做检测由嗜麦芽寡养单胞菌引起的水生动物疾病的快速诊断。通过腹腔注射的方法，将嗜麦芽寡养单胞菌人工感染斑点叉尾鮰，在感染后不同时间剖杀5尾鱼，取心、肝、脾、肾、胃、肠、脑、鳃、皮肤、肌肉等组织进行常规石蜡包埋、切片，应用特异引物对病料组织切片进行原位PCR扩增和原位杂交检测。结果：腹腔注射斑点叉尾鮰4小时后即可在肝脏中检测到少量阳性点，其余器官未出现阳性信号。感染8小时后即可在肾脏和肝脏中检测到少量阳性点，主要分布在肝窦及肾间质部位；16小时后可在机体多个组织器官如肝脏、肾脏、脾脏中检测到；24小时后则进入机体各组织器官，包括肝脏、肾脏、脾脏、肠道、胃、脑中可见；48小时后除了在以上器官可见阳性信号外，还可在心脏、鳃丝中可见到少量阳性信号。性腺、皮肤、鳔、眼睛中始终没有阳性信号的出现。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-15
第一章 文献综述  15-33
  Ⅰ 嗜麦芽寡养单胞菌研究进展  15-23
  Ⅱ 原位PCR技术及其应用  23-31
  研究目的与意义  31-33
第二章 斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶产酶条件优化  33-40
  1 材料与方法  34-35
    1.1 试验菌种  34
    1.2 ECPase活性的测定  34
    1.3 培养基优化  34-35
  2 结果  35-38
    2.1 不同碳源对产酶的影响  35-36
    2.2 不同氮源对产酶的影响  36
    2.3 培养时间对产酶的影响  36-37
    2.4 培养温度对产酶的影响  37-38
    2.5 培养基初始pH值对产酶的影响  38
  3 讨论  38-40
第三章 斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的纯化及性质研究  40-51
  1 材料与方法  41-44
    1.1 材料  41
      1.1.1 试验菌株  41
      1.1.2 实验动物及主要试剂  41
      1.1.3 主要仪器  41
    1.2 方法  41-44
      1.2.1 细菌胞外产物提取  41-42
      1.2.2 胞外蛋白酶的分离纯化  42
        1.2.2.1 硫酸铵盐析  42
        1.2.2.2 DEAE Sephadex A-50层析  42
      1.2.3 蛋白酶活力测定  42-43
      1.2.4 蛋白酶性质研究  43-44
        1.2.4.1 蛋白含量的测定  43
        1.2.4.2 SDS-PAGE电泳分析  43
        1.2.4.3 外界条件及抑制剂对酶的影响  43
        1.2.4.4 提纯蛋白酶的致病性研究  43-44
  2 结果  44-49
    2.1 蛋白浓度测定标准曲线  44
    2.2 嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的分离纯化  44-45
    2.3 SDS-PAGE测定胞外蛋白酶分子量  45-46
    2.4 嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的性质  46-49
      2.4.1 温度对酶活的影响  46-47
      2.4.2 pH对酶活的影响  47
      2.4.3 金属离子对酶活的影响  47-48
      2.4.4 EDTA对酶活的影响  48
      2.4.5 PMSF对酶活的影响  48-49
  3 讨论  49-51
第四章 鱼源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的致病性研究  51-75
  1 材料与方法  52-55
    1.1 试验菌株及试验动物  52
    1.2 试剂及仪器  52-53
    1.3 试验方法  53-55
      1.3.1 胞外蛋白酶的提纯  53
      1.3.2 蛋白酶活力测定  53
      1.3.3 蛋白含量的测定  53
      1.3.4 蛋白酶对小鼠致病性研究  53-54
      1.3.5 蛋白酶对斑点叉尾鮰的致病性  54
      1.3.6 蛋白酶对Vero细胞毒性研究  54-55
  2 结果  55-59
    2.1 提纯的胞外蛋白酶对小鼠的致病性研究  55-57
      2.1.1 小鼠临诊症状与病理解剖  55-56
      2.1.2 小鼠各器官显微组织病理学变化  56-57
    2.2 蛋白酶对斑点叉尾鮰的致病性  57-59
      2.2.1 临诊症状与病理解剖  57
      2.2.2 组织病理变化  57-58
      2.2.3 细胞病理学变化  58-59
    2.3 蛋白酶对Vero细胞毒性  59
  3 讨论  59-62
  图版ⅠECPase45对小鼠的致病性  62-66
  图版ⅡECPase45对Vero细胞毒性  66-68
  图版Ⅲ ECPase45对斑点叉尾(?)的致病性  68-75
第五章 嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的化学修饰  75-81
  1 材料与方法  76-77
    1.1 试验材料  76
      1.1.1 主要试剂  76
      1.1.2 主要仪器  76
    1.2 方法  76-77
      1.2.1 酶的提取  76
      1.2.2 酶活的测定  76
      1.2.3 酶的修饰  76-77
  2 结果与讨论  77-78
    2.1 氨基酸残基的化学修饰  77
    2.2 二硫键和巯基的化学修饰  77-78
    2.3 EDTA对酶活的影响  78
  3 讨论  78-81
第六章 嗜麦芽寡养单胞菌的PCR诊断方法的建立  81-92
  1 材料与方法  82-85
    1.1 材料  82
      1.1.1 菌株、载体、仪器  82
      1.1.2 试剂  82
    1.2 方法  82-85
      1.2.1 嗜麦芽寡养单胞菌菌种的复活  82
      1.2.2 PCR模板的制备  82-83
      1.2.3 引物设计  83
      1.2.4 PCR基础反应体系  83
      1.2.5 PCR基础反应程序  83-84
      1.2.6 PCR产物检测  84
      1.2.7 PCR方法鉴定  84-85
  2 结果  85-90
    2.1 PCR扩增结果  85
    2.2 PCR方法鉴定  85-90
      2.2.1 PCR反应条件优化结果  85-86
      2.2.2 PCR反应系统组成优化结果  86-89
      2.2.3 PCR敏感性测定结果  89
      2.2.4 PCR特异性测定结果  89-90
  3 讨论  90-92
第七章 嗜麦芽寡养单胞菌原位杂交及原位PCR检测  92-102
  1.材料和方法  93-96
    1.1 试验材料  93-94
      1.1.1 试验用菌株  93
      1.1.2 试验动物  93
      1.1.3 试验试剂  93
      1.1.4 主要试验仪器  93-94
      1.1.5 原位PCR引物及特异性探针  94
    1.2 试验方法  94-96
      1.2.1 动物试验及材料的固定  94
      1.2.2 玻片及盖玻片的制备  94
      1.2.3 切片的准备  94
      1.2.4 原位PCR扩增  94-95
      1.2.5 原位杂交  95-96
      1.2.6 结果判断  96
  2 结果  96-97
  3 讨论  97-98
  图版Ⅳ  98-102
第八章 结论  102-103
参考文献  103-115
攻读博士期间发表的论文  115-116
致谢  116

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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