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吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究

作　者: 常金荣
导　师: 王建华
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 吴茱萸碱小檗碱 HT29细胞端粒酶端粒酶逆转录酶
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

大肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。在我国，随着经济的发展，生活方式的改变，大肠癌的发病率也日趋增高，尽管采用了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但效果都不尽理想。现代研究者普遍认为：端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤。端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点，因此目前有大量科学家致力于从端粒酶途径治疗大肠癌的研究。由于中药抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，同时其毒副作用低，不易产生耐药性，日益受到人们的重视。近几年中药抑制端粒酶活性成为肿瘤治疗的热点之一。随着现代生物化学和分子生物学技术的发展，表型遗传学异军突起，已成为许多学科的研究前沿，在肿瘤发生发展方面的研究也逐渐引起了人们的广泛关注。诸多研究表明在肿瘤发生的过程中，除了DNA序列改变外，表型遗传修饰在肿瘤形成过程中具有重要作用。主要包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化。其中DNA甲基化是目前研究的最多、也是最深入的一种表型遗传修饰表达机制。端粒和端粒酶与细胞增殖、分化、癌变及细胞凋亡有关，多种转录因子参与端粒酶逆转录酶(hTERT)的调节。近年来的研究发现DNA甲基化对端粒酶活性的调节具有重要的作用。本研究所对以吴茱萸、黄连、青黛为主药的加味左金丸及其主要成分吴茱萸碱、小檗碱、靛玉红防治胃肠癌的药理作用和临床研究已进行了多年，研究表明，加味左金丸能降低MNNG诱发大鼠胃及十二指肠癌的发生，减轻病理损伤；小檗碱可以明显抑制BGC823、MGC803等胃癌细胞的增殖，降低集落形成率、细胞分裂指数及软琼脂集落形成能力，促进细胞分化，降低肿瘤转移等，同时还可以抑制ras和c-erbB2基因的表达。临床方面，杨传标等观察了连黛胶囊(加味左金丸)治疗30例中晚期胃肠肿瘤患者的疗效及其与中医证型的关系，结果表明连黛胶囊治疗胃癌、大肠癌在改善临床症状和提高生存质量方面有显著疗效，其中对热毒(湿热)证的临床症状疗效最好。我们的课题正是在此基础上，从端粒酶活性及其逆转录酶的表型遗传修饰方面探讨加味左金丸对治疗大肠癌的分子药理机制。研究过程中发现，加味左金丸中的主要单体靛玉红的作用不太明显，故本研究在此基础上进一步研究吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌的抗癌作用机制。一．实验研究1．细胞培养条件的建立采用体外培养细胞的方法，研究了吴茱萸碱和小檗碱从端粒酶及其逆转录酶hTERT甲基化途径对HT29细胞的抗癌作用。选用的细胞为结肠腺上皮癌HT29细胞株，建立和稳定了整个研究工作中所需要的细胞培养条件。主要对细胞传代、细胞冻存和细胞复苏条件进行了优化，在此基础上，通过显微镜观察了细胞形态，采用了WST-8法测定了细胞生长曲线。结果显示，HT29细胞平铺于培养瓶底面积超过瓶底80％时，即可以比例1：2传代；按5×10~6细胞加入冻存液1ml这样的密度冻存；复苏时，液氮罐中取出的细胞，于38℃迅速在1～2min内解冻，细胞接种次日贴壁良好。生长曲线显示，细胞以1×10~5／ml接种后2～3日生长旺盛，此时，细胞处于倍增期前后，适合实验。2．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用首先在体外培养人结肠癌细胞株HT29细胞，采用WST-8方法测定吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞生长抑制作用，并筛选了两种药物作用的最佳时间、有效浓度。结果显示：经过筛选后，作用时间取72h，吴茱萸碱取7.5，15，30μM3个浓度，盐酸小檗碱取52.5，105，210μM3个浓度用于后续实验；吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞具有显著生长抑制作用，具有剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系；相差显微镜动态观察药物作用后，细胞出现胞体缩小，变圆，胞浆混浊，增殖变慢等生长受到抑制的形态方面的变化。采用Annexin V-FITC／PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化，检测结果提示：吴茱萸碱和小檗碱能够诱导细胞凋亡，与空白对照组比较有显著差异性，随药物浓度的增加，凋亡率逐渐增加，表现为量效依赖性；荧光电镜下观察可见到细胞出现核固缩、核碎裂、染色体边集和凋亡小体等典型的细胞凋亡形态学特征。同时本研究还表明吴茱萸碱和小檗碱单独应用有抗大肠癌的作用，而二者合用对HT29细胞产生的抑制细胞增殖作用，与单药组吴茱萸碱的抑制率比较无显著差异性，说明吴茱萸碱和小檗碱对其生长抑制无明显的协同作用。3．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤，它已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点。许多研究表明，端粒酶在大肠癌中高表达，通过观察吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响，探讨其对人结肠癌细胞的作用机制。本实验采用了原位TRAP方法测定端粒酶活性，结果表明吴茱萸碱和小檗碱作用HT29细胞72h后，端粒酶活性明显降低，且随药物浓度逐渐增大，抑制端粒酶活性的作用逐渐增强，呈剂量依赖性；而二者协同用药作用时，和正常对照组比较，端粒酶活性无明显变化，表明吴茱萸碱和盐酸小檗碱联合用药与单独作用无明显变化，进一步证明二者无明显协同作用。4．吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶hTERTmRNA表达的影响端粒酶的活化与肿瘤的发生发展和衰老机制密切相关，而hTERT作为端粒酶的逆转录组分，与端粒酶活性的表达具有密切相关性，能够反映出端粒酶的活性，且多种肿瘤调控因子均通过对hTERT的调节来影响端粒酶的活性，是更加理想的端粒酶抑制靶点。所以我们应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测人结肠癌HT29细胞中hTERT mRNA的表达水平，探讨其对大肠癌细胞端粒酶活性的影响及其抑癌机理。研究结果表明吴茱萸碱和小檗碱能够降低HT29细胞中的hTERT mRNA的表达，且随着药物浓度的增加，表达逐渐降低，具有剂量依赖效应。hTERT mRNA表达代表端粒酶活性，hTERT mRNA表达下降，提示端粒酶活性降低，由此可证明吴茱萸碱和小檗碱影响大肠癌端粒酶活性是通过降低hTERT表达这一途径来完成的。二．结论通过对细胞传代、冻存和复苏条件进行优化，建立了稳定的HT29细胞培养条件，为后续的实验研究奠定了良好的基础；吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞具有显著生长抑制作用，该抑制作用与诱导细胞凋亡相关；能够抑制HT29细胞端粒酶的活性；能够降低HT29细胞中端粒酶逆转录酶hTERTmRNA的表达，间接抑制端粒酶活性；二者无协同作用。三．不足之处虽然研究工作取得了部分阶段性成果，但由于研究方法不太成熟及时间等方面的原因，研究中也存在着一些不太满意的方面，主要有两个方面：一是由于研究方法不太成熟，关于端粒酶逆转录酶hTERT甲基化程度检测方面的实验未预期完成；另一方面，我们只是选取了加味左金丸的主要有效单体吴茱萸碱和小檗碱来研究其抑癌机理，并不能代表中药复方加味左金丸的抑癌作用，如果探讨中药复方的抑癌机理研究，需要运用中药血清药理学，它能够真实地反映药物在体内的整体作用，实现体外实验和体内实验的结合，使实验结果和在体实验有很好的一致性，并能够为临床治疗大肠癌提供实验依据。四．展望本论文是通过对细胞生长抑制、诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性和降低端粒酶逆转录酶hTERT基因表达这四个方面层层深入研究，证明了吴茱萸碱和小檗碱对大肠癌HT29细胞的抑癌作用机理，为今后从转录因子c-myc、SP1等调控基因表达更深层面去研究中药抑癌的作用机制奠定了一定的基础，也为开发新药提供了实验依据。但本研究中表明，吴茱萸碱和小檗碱在HT29细胞生长抑制及端粒酶活性检测方面，二者无协同作用，可能通过其他机制参与了端粒酶活性的调节，有待以后进一步的深入研究。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
引言  13-14
第一部分文献研究  14-31
  第一章中药以端粒酶为靶点治疗大肠癌的研究进展  15-24
    1.端粒及端粒酶  15-17
    2.端粒酶与大肠癌的相关性  17-18
    3.端粒酶在中药治疗大肠癌中的研究进展  18-20
    4.展望  20-21
    参考文献  21-24
  第二章表型遗传修饰对大肠癌端粒酶的调节作用的研究  24-28
    1 端粒和端粒酶  24
    2 hTERT的甲基化调节  24-25
    3 hTERT的乙酰化调节  25-26
    4 结语  26
    参考文献  26-28
  第三章黄连和吴茱萸及其有效成分小檗碱和吴茱萸碱抗肿瘤的研究概况  28-31
    1.黄连及其有效成分小檗碱抗肿瘤作用  28
    2.吴茱萸及其有效成分吴茱萸碱抗肿瘤的作用  28-29
    参考文献  29-31
第二部分实验研究  31-66
  第一章研究目的、内容和意义  33-35
    1.研究目的  33
    2.研究内容  33
    3.研究意义  33-34
    实验技术路线图  34-35
  第二章 HT29细胞的培养  35-41
    引言  35
    1.实验材料  35-36
    2.常用溶液的配制  36
    3.实验方法  36-37
    4.结果  37-38
    5.讨论  38-40
    参考文献  40-41
  第三章吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞的生长抑制和细胞凋亡的作用  41-49
    引言  41-42
    1.实验材料与仪器  42
    2.实验方法  42-44
    3.统计学处理  44
    4.结果  44-47
    5.讨论  47-48
    参考文献  48-49
  第四章吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶活性的影响  49-59
    引言  49
    1.实验材料与试剂的配制  49-51
    2.实验方法  51-52
    3.实验结果  52-53
    4.讨论  53-56
    参考文献  56-59
  第五章吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响  59-66
    引言  59
    1.实验材料和试剂的配制  59-60
    2.实验方法  60-62
    3.统计方法  62
    4.结果  62-63
    5.讨论  63-65
    参考文献  65-66
结语  66-69
  1.本实验研究结果表明  66-67
  2.不足之处  67-68
  3.展望  68-69
第三部分附录  69-73
致谢  73

吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞的抗癌作用及机理研究

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