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磷酸化蛋白质组学定性与定量分析技术的研究及在肝细胞磷酸化蛋白质组学中的应用

作　者: 隋少卉
导　师: 钱小红；王京兰；蔡耘
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 磷酸化蛋白质组 SCX IPG-IEF-TiO2 18O标记 肝细胞
分类号: R341
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，因此也是目前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点，系统地对生物样本中磷酸化蛋白质组的研究有助于阐明磷酸化介导的生理病理机制。但由于生物体内磷酸化蛋白质的含量及磷酸化位点的化学计量值常常很低，大规模分析磷酸化蛋白质在技术上还很具有挑战性。肝脏在机体生命活动中执行多种重要生理功能，其中许多功能是通过可逆的磷酸化修饰调节的，对肝细胞模型的磷酸化蛋白质组的研究有助于人们更深入地理解和认识肝脏的复杂功能以及蛋白质的磷酸化修饰在肝脏功能中的意义。本研究分别从定性分析与定量分析两个层面对肝细胞磷酸化蛋白质组进行了研究。第一部分以标准磷酸化蛋白及酵母蛋白质为样本，首先优化了富集磷酸肽的SCX分离技术路线，接着采用SCX—Q—TOF／SCX—LCQ互补的分析策略对人Chang肝细胞中磷酸化蛋白质进行了研究。共鉴定到559个磷酸化位点、409个磷酸化肽段和370个磷酸化蛋白，其中69％（255／370）的磷酸化蛋白和82％（271／327）的磷酸化位点是Swiss-Prot数据库中没有报道的。分析发现其中许多蛋白质在生物体中发挥着与肝脏的生理和病理密切相关的重要功能。该数据集是目前第一个人正常肝细胞磷酸化蛋白质组的报道，为正常肝细胞与癌细胞对照分析提供了依据。第二部分首先建立了18O标记的磷酸化肽段定量分析技术，并对方法学进行了考察和优化。之后建立了IPG—IEF—TiO2联合分离富集方法与高准确度高灵敏度的LTQ—FT液相色谱质谱联用的磷酸化研究策略，通过比较考察发现该策略不但能有效地对磷酸化肽段进行富集，而且与18O标记定量技术兼容性良好，该工作目前还没有相关文献报道。辅助编写了18O标记定量分析配套软件MSOQ，实现了18O标记定量技术数据处理的自动化及规范化。最后将上述建立的18O-IPO-IEF-TiO2-LTQ-FT技术路线用于HepG2／HepG2-HBx细胞模型的定性及定量磷酸化蛋白质组研究。共鉴定到1358个磷酸化位点，958个磷酸化肽段和895个磷酸化蛋白质（groups）。85％的磷酸化蛋白和90％以上的磷酸化位点是Swiss-Prot数据库中没有报道的。从Chang细胞和HepG2细胞中都发现N端磷酸化肽段占很大比例的现象，推断肝细胞中磷酸化修饰有可能更容易发生在蛋白柔韧性好并暴露在外面的N端区域。稳定同位素标记定量分析得到三方面的差异定量信息：157个差异磷酸化位点，182个差异磷酸化蛋白质和1362个差异非磷酸化蛋白质。还发现有一些磷酸化蛋白质在蛋白水平与磷酸化位点的差异不一致的现象。以上信息的获得为探索由于HBx基因的整合而致HCC的分子机制，寻找一批与肝细胞癌发生发展紧密相关的高特异性和灵敏性的生物标记物奠定了基础。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-23
  一、磷酸化蛋白质组学的富集及定性分析  12-15
    1.蛋白水平上的富集策略  13
    2.磷酸化蛋白质组分析中常用的肽段分离富集技术  13-15
      2.1 固相金属亲和色谱(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)  13
      2.2 离子交换色谱富集法  13-14
      2.3 等电聚焦富集法(Isoelectric Focusing,IEF)  14
      2.4 金属氧化物富集法  14-15
  二、磷酸化蛋白质组学定量分析  15-21
    1.定量分析技术  16-18
      1.1 ~(32)p代谢标记(~(32)P-labeling)和荧光染料染色(Pro-Q Diamond)的磷酸化蛋白质定量分析方法  16
      1.2 稳定同位素标记技术(Stable-Isotope Labeling,SIL)  16-18
        1.2.1 化学标记技术(Chemical Modification)  16-17
        1.2.2 同位素代谢标记技术(Metabolic Labeling)  17
        1.2.3 ~(18)O标记技术(Oxygen-18 Labeling)  17-18
    2.磷酸化蛋白质的质谱分析和鉴定  18
    3.辅助定量分析的计算机软件技术  18-21
  参考文献  21-23
第一部分 基于SCX分离的磷酸化肽段富集策略及在人Chang肝细胞磷酸化蛋白质组定性研究中的应用  23-52
  第一章 基于SCX分离的磷酸化肽段富集策略的研究  25-31
    1.材料与方法  25-27
      1.1 药品与试剂  25
      1.2 仪器及软件  25
      1.3 实验方法  25-27
        1.3.1 蛋白酶切  25
        1.3.2 样品脱盐  25-26
        1.3.3 SCX色谱预分离磷酸肽的方法研究  26
        1.3.4 质谱检测  26-27
    2.结果与讨论  27-31
  第二章 SCX分离—质谱鉴定策略在人Chang肝细胞磷酸化蛋白质组定性研究中的应用  31-48
    1.材料与方法  31-34
      1.1 药品与试剂  31
      1.2 仪器及软件  31-32
      1.3 实验方法  32-34
        1.3.1 样品制备  32
        1.3.2 蛋白酶切  32
        1.3.3 样品脱盐  32
        1.3.4 SCX色谱分离富集磷酸化肽段  32
        1.3.5 质谱分析  32-34
          1.3.5.1 LC-Q-TOF-MS/MS分析鉴定肽段混合物  32-33
          1.3.5.2 LC-ESI-IT-MS/MS分析鉴定肽段混合物  33-34
    2.结果与讨论  34-48
      2.1 SCX对磷酸化肽段的富集  34-36
      2.2 N端磷酸化肽段的分析  36-37
      2.3 新鉴定的磷酸化蛋白及位点分析  37-40
      2.4 Q-TOF和LCQ两种类型质谱仪所得结果的比较  40-44
        2.4.1 磷酸化肽段的中性丢失  40-42
        2.4.2 鉴定的磷酸化肽段类型的分类  42-44
      2.5 磷酸化位点预测与蛋白功能分类  44-48
        2.5.1 磷酸化位点预测  44-47
        2.5.2 GOfact功能分类  47-48
  小结  48-50
  参考文献  50-52
第二部分 基于~(18)O标记的磷酸化蛋白质组学差异定量方法及在HepG2/HepG2-HBx模型中的应用  52-89
  第一章 基于~(18)O稳定同位素标记的磷酸化蛋白质组学差异定量分析方法的建立  55-66
    1.材料与方法  55-56
      1.1 药品与试剂  55
      1.2 仪器及软件  55-56
      1.3 实验方法  56
        1.3.1 ~(18)O稳定同位素标记磷酸化肽段  56
        1.3.2 样品脱盐  56
    2.结果与讨论  56-66
      2.1 ~(18)O稳定同位素标记磷酸化肽段条件的优化  56-61
        2.1.1 标记时间的考察  56-57
        2.1.2 标记后胰蛋白酶的灭活  57
        2.1.3 标记方法的动态范围及灵敏度  57-61
      2.2 ~(18)O标记磷酸化肽段在IPG-IEF与SCX富集路线中稳定性的考察  61-63
      2.3 ~(18)O标记肽段在脱盐条件及TiO_2富集路线中稳定性的考察  63-66
  第二章 HepG2/HepG2-HBx细胞模型的定性及定量磷酸化蛋白质组研究  66-85
    1.材料与方法  67-70
      1.1 药品与试剂  67
      1.2 仪器及软件  67
      1.3 实验方法  67-70
        1.3.1 HBx相关细胞模型的建立及细胞培养  67
        1.3.2 细胞裂解及蛋白酶切  67-68
        1.3.3 SCX色谱预分离磷酸化肽段  68
        1.3.4 IPG-IEF分离富集磷酸化肽段  68
        1.3.5 TiO_2分离富集磷酸化肽段  68
        1.3.6 质谱分析  68-70
          1.3.6.1 液相色谱条件  69
          1.3.6.2 质谱条件  69
          1.3.6.3 质谱数据的检索与分析  69-70
    2.结果与讨论  70-85
      2.1 建立稳定细胞株(由军事医学科学院二所十室博士生方勤美完成)  70
      2.2 IPG-IEF分离富集磷酸化肽段方法的建立及与SCX的比较  70-71
      2.3 TiO_2对磷酸化肽段富集有效性的考察  71
      2.4 磷酸化肽段联合富集路线(IPG-IEF-TiO_2)的建立及评价  71-73
      2.5 HepG2/HepG2-HBx细胞模型中磷酸化蛋白质组定性分析  73
      2.6 鉴定蛋白质的GOfact功能分类:  73-75
      2.7 HepG2/HepG2-HBx细胞模型中磷酸化蛋白质组的差异定量分析  75-85
        2.7.1 MSOQ定量软件的编写  75-78
        2.7.2 差异定量分析  78-85
          2.7.2.1 差异定量分析结果  78-80
          2.7.2.2 差异蛋白质功能信息分析  80-85
  小结  85-87
  参考文献  87-89
结语  89-90
附录  90-107
致谢  107-108
在学期间发表论文  108-110
附：发表文章  110-115

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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