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细菌代谢产物在肿瘤免疫治疗中的应用研究

作　者: 江华
导　师: 祝庆余；姜永强
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 超抗原 CT抗原 NY-ESO-1 金黄色葡萄球菌肠毒素 HSP65
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


肿瘤严重威胁着人类生命健康。传统的化疗、放疗和手术方法存在着各种问题，因此迫切需要寻找新的治疗手段，肿瘤免疫治疗即是这些新的治疗手段之一。实验的第一部分研究了金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)的抗肿瘤作用。作为强大的T细胞激活剂，葡萄球菌肠毒素(SE)治疗肿瘤有着潜在的应用价值。本研究考察了SEC在体内外的抗肿瘤活性。体外共培养实验中，SEC在较低剂量下激活的人外周血淋巴细胞即可以抑制人多种类型肿瘤细胞的生长。在体内系统给予SEC可以显著性地抑制小鼠肿瘤细胞生长；对兔的肿瘤也有一定程度的抑制，同时病理结果显示SEC可以促进肿瘤细胞坏死及肿瘤区域淋巴细胞浸润，抑制肿瘤细胞的转移。以上临床前结果提示SEC是一个较有前景的抗肿瘤候选生物制剂，有待于进行下一步的临床研究。虽然超抗原有很好的临床疗效，但其对T细胞的非选择性激活使得肿瘤细胞特异性的CTL含量很少。因此，如果将超抗原与肿瘤特异性抗原结合使用，理论上应该能够刺激机体产生更多的肿瘤特异性的CTL。在实验的第二部分，为了评价肠毒素能否增强NY-ESO-1特异的细胞免疫应答，首先构建了稳定转染NY-ESO-1的小鼠B16细胞系。通过重叠PCR扩增得到人NY-ESO-1全长编码序列，构建真核表达载体NY-ESO-1-pcDNA3.1(+)，通过脂质体介导转染鼠黑色素瘤B16细胞，经RT-PCR及免疫印迹法鉴定转化细胞中NY-ESO-1的表达，经过G418筛选后，得到了能表达人NY-ESO-1蛋白的B16株。同时，将NY-ESO-1基因克隆至PET-28a(+)原核表达载体中，转化大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导表达，表达产物经Ni柱亲和纯化获得NY-ESO-1蛋白。为了观察超抗原对NY-ESO-1特异性细胞免疫应答的增强作用，将小鼠进行如下分组：NY-ESO-1+SEA／SEB组、NY-ESO-1组、SEA／SEB组和PBS组。对不同组小鼠分别进行免疫后，获取脾淋巴细胞，经NY-ESO-1-B16细胞裂解物刺激后，NY-ESO-1+SEA／SEB组、NY-ESO-1组均能够诱导出针对NY-ESO-1-B16细胞特异性的CTL杀伤活性，且杀伤率分别为44.33％，44.34％，几乎相同，这与ELISPOT的结果相符。ELISPOT结果显示，各组小鼠在免疫后，以NY-ESO-1蛋白体外再次刺激脾淋巴细胞，NY-ESO-1+SEA／SEB组、NY-ESO-1组分泌IFN-γ的T细胞数量较接近，分别为134.81和157.44。与体外结果相似，在小鼠体内同样没有观察到超抗原对NY-ESO-1特异的细胞免疫的增强作用。分别对NY-ESO-1+SEA／SEB组、NY-ESO-1组、SEA／SEB组和PBS组小鼠进行免疫后接种肿瘤，结果显示NY-ESO-1组小鼠的抑瘤率最高，与PBS组相比有显著性差异，而NY-ESO-1+SEA／SEB组的抑瘤率低于单独的NY-ESO-1组。从体内外的结果来看，金黄色葡萄球菌肠毒素没有起到预期的增强NY-ESO-1特异性细胞免疫应答的作用。具体原因有待进一步研究。肿瘤特异性的CTL对肿瘤免疫治疗至关重要，以往的研究发现结核分支杆菌热休克蛋白65与抗原肽结合能有效激活抗原特异的CTL。实验第三部分研究了Hsp65对NY-ESO-1特异性细胞免疫应答的增强作用。首先构建了重组表达质粒HSP65-NY-ESO-1-PET28a，转化大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE凝胶电泳及Westen blot鉴定。结果显示构建的重组原核表达质粒HSP65-NY-ESO-1-PET28a能在大肠杆菌中高效、可溶的表达HSP65-NY-ESO-1融合蛋白。将小鼠分为HSP65-NY-ESO-1组，NY-ESO-1组和PBS组进行免疫，同研究二进行体外ELISPOT实验，结果显示，HSP65-NY-ESO-1组小鼠脾淋巴细胞体外接受同样抗原刺激后分泌IFN-γ的T细胞数为93.56，是NY-ESO-1组的2倍，与PBS组相比有显著性差异；LDH实验结果同样显示，HSP65-NY-ESO-1组小鼠脾淋巴细胞对NY-ESO-1阳性的B16细胞的特异性杀伤率为39.97％，是NY-ESO-1组的10倍左右，与PBS相比也有差异性显著。在体内，HSP65-NY-ESO-1组的肿瘤抑制率是NY-ESO-1组的2倍左右，与PBS组相比差异显著。体内外实验结果均表明，HSP65可以显著增强NY-ESO-1特异的细胞免疫应答。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-17
  恶性肿瘤治疗现状  9
  超抗原  9-11
  肿瘤抗原  11-14
  结核分支杆菌热休克蛋白65  14-17
第一部分 超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素C抗肿瘤研究  17-28
  引言  17-18
  一、实验材料  18-19
  二、实验方法  19-21
  三、实验结果  21-25
  讨论  25-28
第二部分 超抗原对NY-ESO-1特异性细胞免疫应答作用的研究  28-54
  引言  28-29
  一、实验材料  29-31
  二、实验方法  31-42
  三、实验结果  42-49
  讨论  49-54
第三部分 热激蛋白HSP65对NY-ESO-1特异性细胞免疫应答作用的研究  54-67
  引言  54-55
  一、实验材料  55-56
  二、实验方法  56-58
  三、实验结果  58-64
  讨论  64-67
结论  67-68
综述  68-75
参考文献  75-85
致谢  85-86
附录  86-88
缩略词  88-89
在学期间主要发表或待发表的文章  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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