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SEA/SEB对HSP65-MUC1 VNTR_2融合蛋白特异性细胞免疫应答作用的研究

作　者: 郑玉玲
导　师: 王希良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素 热休克蛋白65 MUC1肿瘤免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


金黄色葡萄球菌肠毒素作为强大的T细胞激活剂,对肿瘤的治疗有着潜在的应用价值。研究发现,对小鼠进行抗原免疫后,给予SEA/SEB刺激,可以提高CD4+,CD8+T细胞的数量,CTL细胞的活性和IFN-γ的产生,显著增强小鼠抵御肿瘤的攻击能力,延长小鼠的存活期。研究同时发现,超抗原还能够增强某些抗原特异的体液免疫应答,SEA/SEB混合物对小鼠体内BSA的抗体水平有显著的增强作用,是对照组的4倍以上。但如果用IL-10抑制了超抗原对CD4+激活,那么SEA/SEB对BSA抗体的激活作用也就被相应的抑制了。鉴于超抗原对T细胞的激活作用,本研究设计如果用超抗原SEA/SEB混合物增强肿瘤特异抗原的免疫应答,理论上应该能够产生更强的抗肿瘤作用。研究第一部分通过基因工程的手段在大肠杆菌中表达Hsp65-muc1 VNTR2蛋白,并在鉴定和纯化的基础上,研究其在动物体内的预防肿瘤生长的活性。热休克蛋白(Heat shock protein, HSP)又称应激蛋白,是一类在进化上高度保守具有重要生理功能的蛋白质分子。近年来发现HSPs与肿瘤免疫密切相关,它能与细胞内多种肽分子结合,通过APC细胞上的受体诱导特异性的抗肿瘤免疫应答。HSPs-肽复合物具有肿瘤疫苗作用,已成为目前研究的热点之一。MUC1是Mucins粘蛋白的一种,存在于正常腺管上皮及其来源的肿瘤细胞表面。它是一种大分子的糖蛋白,由多肽核心和侧枝糖链构成,其多肽核心的胞外段含有20个氨基酸的串联重复序列(variable numbers tandem repeats, VNTRs)。在多种肿瘤中,MUC1异常表达,主要表现为表达量增高,细胞表面极性分布的改变和结构改变等,成为免疫细胞攻击的靶点。研究发现MUC1核心肽的PDTRP表位不仅能被MUC1抗体识别,而且也能被CTL细胞识别和杀伤,且不受MHC的限制,成为理想的抗肿瘤分子。研究首先通过重叠PCR获得人muc1基因的两个重复的VNTRs,构建重组表达载体Hsp65-muc1VNTR2-pET28a(+),实现该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中稳定可溶性表达,利用鼠抗人MUC1单克隆抗体进行Western印迹鉴定,结果阳性;通过Q柱和凝胶过滤纯化获得纯化蛋白,纯度达95%以上;在C57BL/6小鼠体内对MUC1阳性B16肿瘤的预防实验中,通过剂量梯度筛选,2.5μg/只剂量组的抑制率为72.08%,与PBS组相比有极显著的差异,成瘤率为50%;10μg/只剂量组的肿瘤抑制率为37.29%,与PBS组相比差异不显著。该蛋白高剂量和低剂量均能够抑制表达MUC1肿瘤的生长,但低剂量的效果较高剂量更好,说明HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白可刺激小鼠产生细胞免疫应答,抑制表达MUC1的肿瘤生长。本研究成果为进一步评价其作为肿瘤疫苗可能性的研究打下了基础。超抗原对T细胞的非选择性激活使得肿瘤细胞特异性的CTL含量很少,限制了其强大抗肿瘤作用的发挥。因此,如果将超抗原与肿瘤特异性抗原结合使用,理论上应该能够刺激机体产生更多的肿瘤特异性的CTL。实验第二部分,为了观察超抗原对HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白特异性细胞免疫应答的增强作用,将C57BL/6小鼠进行如下分组:HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组、HSP65-MUC1 VNTR2组、SEA/SEB组和PBS组。对不同组小鼠分别进行免疫后,获取脾淋巴细胞,经MUC1VNTR2肽刺激后,HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组、HSP65-MUC1 VNTR2组均能够诱导出针对MUC1-B16细胞特异性的CTL杀伤活性,且杀伤率分别为36%,30%左右。ELISPOT结果显示,各组小鼠在免疫后,以MUC1 VNTR2肽体外再次刺激脾淋巴细胞,HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组分泌IFN-γ的T细胞数量最大,约81.22,是HSP65-MUC1 VNTR2组的2倍左右,与PBS组比,差异显著。在C57BL/6小鼠体内同样观察到超抗原对HSP65-MUC1 VNTR2特异的细胞免疫的增强作用。分别对HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组、HSP65-MUC1 VNTR2组、SEA/SEB组和PBS组小鼠进行免疫后接种肿瘤,结果显示HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组小鼠对MUC1阳性的B16肿瘤的抑瘤率最高,达到62%左右,与PBS组相比有显著性差异,而其它组与PBS组相比均没有显著性差异。体内对MUC1阴性的B16肿瘤的抑制研究结果表明,SEA/SEB诱导增强的是HSP65-MUC1 VNTR2特异的T细胞,对MUC1阴性的B16细胞的抑制率与PBS组相比没有显著性差异。对HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB联合免疫治疗效果的进一步研究结果显示,只有HSP65-MUC1 VNTR2+SEA/SEB组的抑瘤率与PBS组相比有显著性差异,而且该组小鼠的存活期最长达到58天。体内外实验结果均表明,SEA/SEB可以增强HSP65-MUC1 VNTR2特异的细胞免疫应答。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-11
英文缩略语  11-12
前言  12-21
  1 热休克蛋白及其在肿瘤免疫研究中的进展  12-14
    1.1 热休克蛋白的结构和功能  12
    1.2 热休克蛋白与抗原呈递  12-13
    1.3 热休克蛋白与肿瘤免疫  13-14
  2 MUC1 的结构及在机体免疫调节中的作用  14-15
    2.1 MUC1 的结构  14-15
    2.2 MUC1 在机体免疫调节中的作用  15
  3 HSP_(s-)多肽肿瘤疫苗的研究进展  15-17
    3.1 天然HSP-多肽肿瘤疫苗  15-16
    3.2 人工合成HSP-多肽肿瘤疫苗  16
    3.3 HSP-多肽融合蛋白肿瘤疫苗  16-17
  4 以MUC1 为靶点的肿瘤疫苗研制的进展  17-18
  5 超抗原  18-21
    5.1 超抗原的概念  18-19
    5.2 超抗原与T 细胞结合的特征  19
    5.3 超抗原的生物学意义  19-21
第一部分 HSP65-MUC1 VNTR_2融合蛋白的表达、纯化及抗肿瘤活性研究  21-35
  一、实验材料  21-22
    1.1 菌株和质粒  21
    1.2 试剂  21-22
  二、实验方法  22-28
    2.1 BCG HSP65 编码序列的获取  22-23
    2.2 HSP65-pMD18-T 克隆载体的构建  23
    2.3 HSP65-pMD18-T 克隆载体的转化  23-24
    2.4 HSP65-pMD18-T 阳性克隆的鉴定  24
    2.5 HSP65-pET28a 重组质粒的构建  24
    2.6 人MUC1 蛋白VNTRs 单个重复序列的获得  24
    2.7 MUC1 VNTR1-pMD18-T 阳性克隆的鉴定  24
    2.8 HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a 重组表达质粒的构建  24-25
    2.9 HSP65-MUC1 VNTR2 融合蛋白的表达  25-26
    2.10 HSP65-MUC1 VNTR2 融合蛋白的纯化  26
    2.11 HSP65-MUC1 VNTR2 蛋白的免疫印迹检测  26-27
    2.12 MUC1 转染细胞Western blot 鉴定  27
    2.13 MUC1 转染细胞肿瘤组织免疫组化鉴定  27-28
    2.14 HSP65-MUC1 VNTR2 蛋白对MUC1-816 肿瘤的免疫预防的效果  28
  三、实验结果  28-33
    3.1 结核分支杆菌HSP65 基因扩增  28
    3.2 重叠PCR 获取人MUC1 VNTR1 序列  28-29
    3.3 HSP65-MUC1 VNTR2 蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化  29-30
    3.4 HSP65-MUC1 VNTR2 蛋白的Western 印迹鉴定  30
    3.5 MUC1-816 转染细胞Western blot 鉴定  30-31
    3.6 MUC1-816 转染细胞肿瘤组织免疫组化鉴定  31
    3.7 HSP65-MUC1 VNTR2 蛋白对MUC1-816 肿瘤的体内免疫预防的实验结果.  31-33
  讨论  33-35
第二部分 SEA/SEB 对 HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白特异性细胞免疫应答作用的研究  35-50
  一、实验材料  35-36
    1.1 试剂  35-36
    1.2 细胞和动物  36
    1.3 仪器  36
  二、实验方法  36-40
    2.1 动物分组与免疫  36-37
    2.2 细胞免疫反应的检测  37-38
    2.3 细胞毒性实验  38-39
    2.4 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对MUC1-816 肿瘤的体内预防作用  39
    2.5 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对816 肿瘤的体内预防作用  39
    2.6 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对MUC1-816 肿瘤的体内治疗作用  39-40
    2.7 HSP65-MUC1 VNTR2结合超抗原SE对MUC1-816肿瘤体内治疗的病理学观察  40
  三、 实验结果  40-47
    3.1 ELISPOT 检测MUC1 VNTR2 特异性T 细胞  40-41
    3.2 细胞毒性实验  41-42
    3.3 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对MUC1-816 肿瘤的体内预防作用  42-43
    3.4 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对816 肿瘤的体内预防作用  43
    3.5 HSP65-MUC1 VNTR2 结合超抗原SE 对MUC1-816 肿瘤的体内治疗作用  43-46
    3.6 HSP65-MUC1 VNTR2结合超抗原SE对MUC1-816肿瘤体内治疗的病理学观察  46-47
  讨论  47-50
结论  50-51
参考文献  51-54
附录  54-55
综述  55-58
致谢  58-59
在学期间主要发表或待发表的文章  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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