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水稻OsCAS（Calcium-sensing Receptor）基因的克隆及功能分析

作　者: 赵昕
导　师: 裴真明；何奕昆
学　校: 首都师范大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻胞外Ca2+信号转导钙敏感受体(CAS)
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

Ca²⁺是动植物生长发育过程中主要的营养物质，同时Ca²⁺信号传递又是细胞中重要的信号转导途径之一，参与和调节着生物体的生长、发育、抗逆等生理反应。胞内Ca²⁺作为重要的第二信使，控制着许多细胞功能，人们对此研究得已经比较深入。直到1993年，Brown et.al.首次从牛副甲状腺中克隆到了一个G-蛋白耦联的胞外Ca²⁺敏感受体（CaR），使人们认识到Ca²⁺在细胞外也发挥着信使的功能。2003年Han and Pei在拟南芥叶片中采用表达克隆的方法克隆到一个胞外Ca²⁺敏感受体（CAS），能够感受胞外Ca²⁺浓度的升高，从而引起胞内Ca²⁺浓度的升高。这个受体的克隆使人们认识到在植物当中Ca²⁺也可以发挥第一信使的作用。我们利用拟南芥CAS基因序列在GeneBank中比对，发现水稻中存在与之相似性很高的序列，采用同源克隆的策略，在水稻中克隆了OsCAS基因，并对它的序列和功能作了初步的分析和研究。所得序列在GenBank注册，基因号：AY476807。序列分析表明，OsCAS包含1164个碱基对，编码387个氨基酸；在水稻基因组中为单拷贝；计算机软件分析该蛋白具有一个跨膜结构域，在30-50氨基酸处有一段导肽序列。推测OsCAS的C-端位于细胞内，它的作用可能与蛋白质间的相互作用有关，在C端具有一个硫氰酸酶结构域，这个保守区域在磷脂酶和多种蛋白中都有发现，比如在硫氰化酶和一些抗性蛋白中，推测它有可能在一些抗逆反应中具有一定的作用；N-端位于胞外，具有几个酸性氨基酸残基能够结合Ca²⁺，但没有发现其他保守区域，并且与拟南芥CAS的同源性也较差，可能与胞外Ca²⁺的结合方式的多样性有关。为研究OsCAS基因的功能，我们做了以下几方面的工作：1．在HEK293细胞系中表达OsCAS。用空载体pcDNA₃、水稻OsCAS、拟南芥CAS转化HEK293细胞系。当[Ca²⁺]_o由0.1mM升高到2.5mM时，我们观察到胞内Ca²⁺信号迅速上升，说明OsCAS具有感受胞外Ca²⁺浓度升高从而引起胞内Ca²⁺浓度升高的功能。2．进行OsCAS的细胞学定位。构建UBQ p∷CAS∷eGFP和UBQp∷eGFP转化洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察，发现OsCAS定位在质膜上。3．对OsCAS表达部位进行研究。提取水稻不同部位（根、茎、叶）的RNA，逆转录成cDNA，然后进行实时定量PCR反应，结果表明，OsCAS在叶中表达量很高，茎中也有表达，但明显低于叶中的表达量，在根中几乎不表达。4．对OsCAS功能进行研究。构建OsCAS的sense和anti-sense表达载体转化水稻，得到CAS超表达和转基因抑制植株T₀代。T₀代anti-sense转基因植株在生长发育各个方面与野生型植株相比明显迟缓。对其T₁代进行抗逆性研究，发现在OsCAS的表达明显被抑制的情况下，用200mM NaCl处理24小时后，转基因植株表现出对NaCl敏感，转基因植株的叶绿素含量和叶片游离脯氨酸含量明显低于野生型，而且在外加Ca²⁺的情况下，植物的盐胁迫症状没有明显的改变，而野生型的植株在相同条件下盐胁迫的症状有所缓解。通过对OsCAS基因的序列及功能分析可以得出以下结论：CAS是位于质膜表面的Ca²⁺受体，能够感受胞外Ca²⁺浓度的变化，从而引起胞内Ca²⁺浓度变化。OsCAS基因的表达对水稻的生长发育非常重要，当该基因受到抑制，植株表现出长势弱、抽穗晚，抗逆（盐）性降低。我们分析产生这种现象的原因可能有两个：第一，CAS作为IP₃途径的受体，能够引起Ca²⁺从细胞内钙库释放出来，当它被抑制时，细胞的PLC信号转导途径被破坏，不能引起胞内Ca²⁺浓度增加，影响了逆境应答基因的表达，而且IP₃途径的破坏，使Pro的积累受到影响，而脯氨酸的积累是生物有机体对环境胁迫产生的一种应答反应，能够增强植物的抗逆能力。第二，在高盐条件下Ca²⁺对于排斥Na⁺而加强K⁺的选择性吸收是必要的。总之，当水稻OsCAS的表达受到抑制时，胞内Ca²⁺信号途径被破坏，从而使植物的耐盐性下降。Ca²⁺作为植物体信号转导复杂网络中的一个重要组分，往往参与到许多信号途径中，有关以上变化的分子机理还有待于进一步的研究。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
缩写及中英文对照  9-11
目录  11-13
第一章文献综述  13-45
  第一节植物钙信号系统  13-23
  第二节动植物中的胞外Ca~(2+)信号  23-33
  第三节钙信使在植物适应非生物逆境中的作用  33-43
  本研究的目的及意义  43-45
第二章水稻OsCAS基因的克隆、表达载体的构建及转化  45-67
  第一节水稻OsCAS基因的克隆  45-57
    一、实验材料及试剂  45-46
    二、实验方法  46-49
      1.水稻OsCAS基因的RT-PCR扩增  46-47
      2.目的基因与T-vector连接  47-49
    三、实验结果分析  49-56
      1.水稻总RNA的提取及RT-PCR扩增目的基因  49-50
      2.目的基因与T-vector连接  50-51
      3.OsCAS基因及蛋白结构分析  51-56
    四、讨论  56-57
  第二节表达载体的构建及水稻转化  57-67
    一、实验材料及方法  57-62
      1.表达载体的构建  57-58
      2.表达载体对农杆菌EHA105的转化  58-59
      3.根癌农杆菌介导的水稻转化  59-62
    二、实验结果分析  62-66
      1.pCUbi1390-CASs和pCUbi1390-CASa表达载体的构建及对农杆菌的转化  62-63
      2.根癌农杆菌介导的水稻转化  63-66
    三、讨论  66-67
第三章 OsCAS基因的功能分析  67-91
  一、实验材料及方法  68-77
    1.UBQp::CAS::EGFP载体构建及转化洋葱表皮细胞  68-72
    2.载体pcDNA_3-CAS的构建及转化HEK239细胞  72-73
    3.转基因植株的鉴定  73-76
    4.植物组织叶绿素含量的测定  76-77
    5.脯氨酸的提取及含量测定  77
  二、实验结果分析  77-87
    1.pcDNA_3-CAS载体构建及转化HEK293动物细胞系  77-79
    2.CAS的细胞学定位  79-81
    3.转基因植株的鉴定  81-82
    4.转基因植株当代的表型分析  82-83
    5.转基因植株T_1代分析  83-87
  三、讨论  87-91
    1.pcDNA_3-CAS载体转化HEK293动物细胞系  87-88
    2.OsCAS在植物体中的表达部位及亚细胞定位  88
    3.OsCAS的功能分析  88-91
结论  91-93
参考文献  93-107
致谢  107-108

水稻OsCAS（Calcium-sensing Receptor）基因的克隆及功能分析

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