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丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶BRSK2功能的初步研究

作　者: 郭泽坤
导　师: 余龙
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: BRSK2 Ser/Thr蛋白激酶 AMPK PKA 磷酸化 细胞功能
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


蛋白激酶通过对蛋白底物的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化调节蛋白质的生物活性状态，这一过程在许多细胞活动中起着十分重要的作用，例如，细胞内外信号传导，细胞内运输，细胞周期进程等。我们通过电子杂交的方法从Genbank数据库中获得了BRSK2基因序列，该基因含有2025bp的开放阅读框，编码674个氨基酸残基，定位于11q15.5，含有21个外显子。BRSK2的氨基酸序列19-270位氨基酸残基编码一个Ser／Thr蛋白质激酶结构域，根据其激酶结构域的氨基酸序列同源性，将其归类于CAMK蛋白激酶家族的AMPK亚家族。BRSK2氨基酸序列的10-674位氨基酸残基还含有一个与细胞周期调控、细胞分裂以及染色体分离相关的KOG0588结构域，而且BRSK2是AMPK家族成员中唯一具有完整该结构域的蛋白激酶。组织表达谱分析表明BRSK2在脑和胰隙中呈现特异性的高表达，并且胰腺组织中的表达丰度要比脑组织中的表达丰度高10倍以上。免疫荧光实验将BRSK2在HeLa细胞内定位于核周区域。根据BRSK2激酶结构域与AMPK的同源性，我们用AMPK的底物SAMS多肽来检测BRSK2的激酶活性，实验结果表明BRSK2能够磷酸化SAMS多肽，而不能磷酸化突变多肽SAMA。对BRSK2细胞功能的研究发现BRSK2在葡萄糖饥饿胁迫条件下能够促进细胞存活率，抑制蛋白质合成，阻滞细胞周期在G2／M期，以及激活AP1、NFAT、HSE等细胞信号转导通路。我们在BRSK2发现了一个PKA的磷酸化位点Thr260，实验证明Thr260能够在体外被PKA磷酸化，并且PKA的磷酸化能够促进BRSK2的活性，将Thr260突变为丙氨酸，可导致激酶活性的降低，并导致BRSK2在促进细胞存活、蛋白质合成抑制、G2／M期阻滞和AP1激活等方面的功能的部分降低。已经有报道证明LKB1能够磷酸化激活BRSK2的Thr174，Thr174的突变可导致BRSK2活性的丧失。我们对比了Thr174以及Thr260位点的突变对BRSK2细胞功能的影响。实验结果表明Thr174位点的突变导致BRSK2功能的完全丧失，而Thr260的突变仅导致BRSK2功能的部分丧失，说明Thr174位点的磷酸化是BRSK2活性和功能所必需，该位点的突变将导致BRSK2功能的完全丧失，而Thr260的磷酸化对激酶活性具有调控作用，可能调控Thr174位点的磷酸化。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-11
材料与方法  11-34
  一、材料  11-18
    1.cDNA分子库  11
    2.质粒载体  11-12
    3.宿主菌  12
    4.细胞株  12
    5.引物  12-13
    6.实验材料及试剂盒  13-14
    7.实验试剂  14-18
  二、主要仪器设备  18-19
  三、计算机分析软件  19-20
    1.国际NCBI(National Center for Biotechnology Information)信息途径:  19
    2.核酸及蛋白质序列分析软件:  19-20
    3.图象处理软件  20
    4.数据分析及其统计软件  20
  四、实验方法  20-34
    1.技术路线和实验方案  20
    2.全长cDNA的克隆  20-21
    3.目的克隆片段的测序验证  21-22
    4.组织表达谱分析  22-24
    5.表达载体的构建  24-25
    6.细胞培养和瞬时转染  25-26
    7.Western blotting  26-27
    8.免疫荧光定位  27-28
    9.细胞周期测定  28-29
    10.细胞存活率检测  29
    11.双荧光素酶报告反应系统检测荧光素酶活性  29-30
    12.BRSK2的原核细胞表达与纯化  30-32
    13.激酶活性测定  32-33
    14.蛋白同源比较,无根树分析  33-34
结果  34-66
  1.BRSK2基因的克隆和序列分析  34-44
  2.BRSK2基因的染色体定位和基因组结构分析  44-45
  3.BRSK2的表达谱分析  45
  4.BRSK2的亚细胞定位  45-46
  5.BRSK2的原核表达  46-47
  6.BRSK2的激酶活性分析  47-49
  7.PKA对BRSK2的磷酸化作用  49-51
  8.PKA磷酸化BRSK2的Thr260对激酶活性的影响  51-52
  9.BRSK2对糖饥饿胁迫下的细胞存活率的影响  52-55
  10.BRSK2对蛋白质合成的抑制作用  55-57
  11.BRSK2对细胞周期的影响  57-61
  12.BRSK2对信号通路的激活作用  61-62
  13.Thr174和Thr260的磷酸化对BRSK2功能的影响  62-66
讨论  66-72
小结  72-74
参考文献  74-77
文献综述 AMPK的功能及其调控  77-92
  一.AMPK的研究历史  78-79
  二.AMPK的结构  79-82
  三.AMPK的调控  82-85
    1.AMPK的磷酸化调控  82-83
    2.AMP对AMPK的调控作用  83-84
    3.AMPK的细胞内调控  84-85
  四.AMPK的下游底物  85-90
    1.AMPK的底物识别序列  85-86
    2.AMPK的体内底物蛋白  86-90
  五.AMPK与疾病  90-92
参考文献  92-99
致谢  99-100

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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