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番茄RAPD聚类分析、抗ToMV番茄cDNA文库构建和分离RGA的研究

作　者: 李焕秀
导　师: 雷建军；宋明
学　校: 西南农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄(Lycopersicoum esculentum Mill) 抗ToMV番茄cDNA文库构建抗病基因类似序列(RGA)
分类号: S436.412
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 398次
引　用: 4次
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内容摘要

番茄病毒病是番茄的重要病害之一,是世界性的病害,危害十分严重。番茄花叶病毒（ToMV）又是病毒病中危害最严重、危害作物种类最多的病毒病,严重影响番茄的产量和品质。选育抗ToMV的品种是防治番茄病毒病最有效的途径。选育抗ToMV的番茄材料可以依靠传统的抗病育种方法,也可以利用抗病基因工程。随着植物抗病机制的分子生物学和抗病基因工程研究的深入发展,植物抗病基因的分离和转化为高效育种展示了广阔前景。本试验以20个番茄材料为试材,应用田间调查和实验室酶活性、同工酶等方法,对番茄材料对ToMV的抗性进行了鉴定,研究了过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）酶液提取及反应适宜条件;应用RAPD技术对20个番茄材料进行亲缘关系的鉴定;用抗ToMV番茄材料,构建了抗病番茄cDNA文库;根据烟草和拟南芥抗病基因同源保守序列设计简并引物,分离番茄基因组DNA中的抗病基因类似片段RGA。通过研究,得出以下结果: 1、番茄材料ToMV抗性分类对国内主栽番茄材料和四川农业大学收集的番茄育种材料共20份进行了ToMV抗性研究。根据品种资料介绍及田间试验和室内接种ToMV后番茄发病率和病情指数鉴定结果,以病情指数为主要指标,参照ToMV抗性分级标准,初步可将20份番茄材料对ToMV的抗性分为四类。 ① 高抗材料（HR）:黄圣果和美国番茄; ② 抗性材料（R）:中杂9号、W_262-4、黄叶番茄和Oh-2-2-11; ③ 耐病材料（T）:L-402、美味樱桃番茄、加州大红1号、早红宝、宝大903和川杂-10; ④ 感病材料（S）:今科红玫、大红番茄合作903、加州大红4号、改良美国903、宝岛巨星、W₂₆₂、Oh-2-2-6和金刚2号大番茄。

全文目录

摘要  8-11
Abstract  11-15
第1章文献综述  15-26
  1.1 番茄病毒病危害现状  15-16
  1.2 防治番茄病毒病的方法  16
  1.3 抗病毒基因工程主要策略研究进展  16-19
    1.3.1 病毒来源基因介导的病毒病抗性  16-18
    1.3.2 非病毒来源基因介导的病毒抗性  18-19
  1.4 利用同源序列分离植物抗病基因研究进展  19-24
    1.4.1 抗病基因(R gene)研究进展  19-21
    1.4.2 抗病基因类似序列(RGA)研究进展  21-24
  1.5 酶活性变化与植物抗病性关系的研究概况  24
  1.6 同工酶在蔬菜病理研究中的应用  24-25
  1.7 cDNA文库的作用及研究进展  25-26
第2章引言  26-29
  2.1 研究的目的和意义  26-27
  2.2 主要研究内容  27
    2.2.1 番茄材料抗ToMV的田间筛选鉴定  27
    2.2.2 番茄材料抗ToMV的室内接种及其生化分析鉴定  27
    2.2.3 番茄材料RAPD聚类分析  27
    2.2.4 构建抗ToMV番茄cDNA文库  27
    2.2.5 番茄材料RGA分析  27
  2.3 采用的技术路线  27-29
    2.3.1 实验步骤  27
    2.3.2 技术路线  27-29
第3章材料与方法  29-53
  3.1 番茄抗ToMV材料的田间筛选  29-30
    3.1.1 材料  29
    3.1.2 试验和筛选方法  29-30
  3.2 室内ToMV接种鉴定  30-31
    3.2.1 材料及其播种  30
    3.2.2 供试ToMV病毒源与接种方法  30-31
  3.3 生化指标测定  31-34
    3.3.1 不同pH提取液对POD和PPO活力的影响  31-32
    3.3.2 PPO最佳波长和最佳反应时间的选择  32
    3.3.3 接种与未接种ToMV番茄材料POD、PPO活性测定  32
    3.3.4 接种与未接种ToMV番茄材料PAL酶液提取及活性测定  32
    3.3.5 酶比活力计算  32
    3.3.6 不同凝胶浓度POD和PPO同工酶电泳  32-34
    3.3.7 接种与未接种ToMV番茄材料POD和PPO同工酶电泳  34
  3.4 抗ToMV番茄cDNA文库构建  34-47
    3.4.1 材料  34-36
    3.4.2 方法  36-47
  3.5 番茄材料遗传多样性RAPD分析  47-49
    3.5.1 材料  47-48
    3.5.2 方法  48-49
  3.6 抗病基因类似物(RGA)的分离鉴定  49-53
    3.6.1 材料  49-50
    3.6.2 方法  50-53
第4章结果与分析  53-77
  4.1 番茄材料田间ToMV抗性比较  53-54
    4.1.1 番茄生长发育状况  53
    4.1.2 番茄材料田间ToMV抗性比较  53-54
  4.2 室内接种ToMV和生化鉴定  54-66
    4.2.1 苗期接种ToMV发病率调查  54-55
    4.2.2 苗期接种ToMV病情指数调查  55-56
    4.2.3 POD和PPO反应适宜发件  56-58
    4.2.4 番茄材料POD同工酶分析  58-59
    4.2.5 POD活性与ToMV抗病性的关系  59-60
    4.2.6 PPO活性与ToMV抗病性的关系  60-62
    4.2.7 PAL活性与抗病性的关系  62-63
    4.2.8 同工酶电泳结果分析  63-66
  4.3 抗ToMV番茄cDNA文库构建  66-70
    4.3.1 RNA提取  67
    4.3.2 mRNA分离  67
    4.3.3 cDNA合成和文库构建  67-69
    4.3.4 原库滴度及重组率测定  69
    4.3.5 cDNA文库的扩增及扩增文库滴度测定  69-70
  4.4 番茄材料RAPD分析  70-75
    4.4.1 模板DNA提取效果  70-71
    4.4.2 引物筛选  71-72
    4.4.3 RAPD标记的多态性分析  72
    4.4.4 遗传距离和树型分析  72-74
    4.4.5 供试番茄材料的遗传变异特性  74-75
  4.5 番茄RGA的PCR扩增  75-77
    4.5.1 简并引物的设计  75
    4.5.2 番茄基因组DNA RGA的PCR扩增效果  75-77
第5章讨论  77-90
  5.1 番茄材料田间抗病性和室内接种ToMV抗病性鉴定  77
  5.2 番茄材料生化特性与ToMV抗病性  77-79
    5.2.1 POD和PPO反应最佳条件  77
    5.2.2 POD与番茄材料ToMV抗性的关系  77-78
    5.2.3 PPO与番茄材料ToMV抗病性的关系  78
    5.2.4 PAL与番茄材料ToMV抗病性的关系  78-79
    5.2.5 不同分离胶浓度对电泳效果的影响  79
    5.2.6 POD和PPO同工酶与番茄材料ToMV抗病性的关系  79
  5.3 抗ToMV番茄cDNA文库构建  79-84
    5.3.1 RAN的提取  79-80
    5.3.2 cDNA的合成  80-81
    5.3.3 XL1-Blue MRF‘菌株的特点  81-82
    5.3.4 铺盘噬菌体细胞的生长  82
    5.3.5 用IPTG和X-gal选择重组体  82
    5.3.6 辅助噬菌体及其贮存  82-83
    5.3.7 cDNA文库构建和扩增  83-84
  5.4 番茄材料RAPD分析  84-86
    5.4.1 DNA提取  84
    5.4.2 RAPD技术的可靠性  84-85
    5.4.3 RAPD标记带中的强带和弱带  85
    5.4.4 对照中出现的带  85-86
    5.4.5 番茄材料遗传多样性  86
  5.5 RAG分析  86-90
    5.5.1 同源序列简并引物的设计  86
    5.5.2 同源序列法分离RGA  86-88
    5.5.3 同源序列法分析的优越性、稳定性和重复性  88-89
    5.5.4 同源序列法分离RGA的意义  89-90
第6章结论  90-93
  6.1 番茄材料ToMV抗性分类  90
  6.2 氧化酶最佳反应条件研究  90
  6.3 氧化酶活性与抗病性关系  90
  6.4 POD和PPO同工酶与ToMV抗性关系  90-91
  6.5 抗ToMV番茄cDNA文库构建  91
  6.6 RAPD分析  91-92
  6.7 RAG分析  92-93
第7章研究的创新点和需进一步研究的内容  93-94
  7.1 研究的创新点  93
  7.2 需进一步研究的内容  93-94
参考文献  94-102
附录1：  102-104
附录2：  104-106
致谢  106-107
在读期间发表论文及承担科研课题  107

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