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结直肠癌癌旁粘膜CpG岛异常甲基化的研究

作　者: 朱益民
导　师: 来茂德
学　校: 浙江大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 癌旁粘膜异常甲基化结直肠癌 CpG岛 DNA甲基化正常组织相似性分析肿瘤分子生物学肿瘤相关基因免疫组织化学法
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

研究背景结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种严重威胁人类健康的常见消化系统恶性肿瘤。在西方发达国家居民恶性肿瘤死因顺位中结直肠癌位居第二，在我国恶性肿瘤死因顺位中居4-6位。近二十年来我国结直肠癌发病率基本上呈现上升趋势，特别在城市以及发达农村地区，增速尤其以结肠癌更为明显。随着我国居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的危险性还会持续上升。因此结直肠癌发病机制以及防治策略的研究有十分重要意义。从正常细胞发展到肿瘤是一个漫长而复杂的过程，涉及多阶段、多步骤、多基因作用。随着肿瘤分子生物学研究的深入，发现越来越多的基因改变参与到结直肠癌发生、发展过程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活是基因改变的两个重要方面，涉及遗传与表遗传的改变。遗传性改变是过去20年肿瘤分子生物学研究的基础。表遗传是一种由非DNA序列改变引起的，可遗传的基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白的乙酰化和染色质的构型改变浙江大学博士学位论文等。DNA甲基化是影响表遗传机制的主要因素，基因的5’端启动子和第一外显子CpG岛的甲基化与基因表达抑制、基因功能缺失有关。许多抑癌基因如pl6，ER，BRCAI，加MLHI等通过DNA异常甲基化而失活。与正常细胞相比肿瘤细胞的基因组CpG岛的甲基化状态存在差另.J。因此从研究正常组织和癌组织差异的甲基化序列出发，可以寻找新的肿瘤相关(抑癌)基因，这些基因的异常甲基化可能与肿瘤的发生、发展有关。目前DNA甲基化的研究已成为肿瘤相关基因特别是抑癌基因研究的新途径。研究目的研究结直肠癌癌旁粘膜和正常结肠组织CpG岛甲基化的分布差异，分析结直肠癌发生早期的异常CpG岛甲基化改变，探索结直肠癌发生过程中甲基化作用的(新的)肿瘤相关基因。对分离到的差异甲基化序列2F811相关墓因一staufen基因在结直肠癌病人不同组织中的表达情况进行分析。研究方法甲基化CPG岛扩增方法(MCA)富集基因组内甲基化CpG岛将基因组DNA用限制性内切酶及刀:灭活后用同裂酶火孙，习I消化，两次消化产物经酚/氛仿抽提纯化后I消化，在T4DNA连接酶的作用下与含相同粘端的接头RXMA24/12连接，然后PCR扩增含有接头的DNA片段。代表性差异分析(RDA)筛选差异的甲基化片段将癌旁粘膜的MCA产物用曰丫万〕习I消化，切除接头，重新形成粘末端，并与新接头如JXMA24/12、第4页共97页浙江大学博十学位论文RMCA24八2等连接，以此作为检测子;用sm:I酶切除正常结肠组织的MCA产物的接头，形成平末端，以此作为驱赶子。将检测子和驱赶子按1:50一:100的比例进行杂交，用绿豆核酸酶消化单链DNA后的产物作为模板进行PCR扩增，获得差异甲基化DNA。对第1轮分析获得的甲基化差异片段再用入初习工酶切除接头，连接不同接头(有相同粘端)，进行第2轮RDA分析如此依次进行四轮RDA分析。第1一4轮分析所用的接头分别为R人ICA24/12、JxMA24/12、RMCA24/12、JXMA24八2。克隆、测序及相似性分析对第4轮RDA分析产物经克隆、测序后获得的序列，采用RePea二asker分析系统进行重复序列分析，用BLAST系统对所测的序列进行相似性分析，并通过GenBank搜索分析克隆序列与相关基因的关系。点杂交分析采用随机引物法，以地高辛标记的差异甲基化片段了A12为探针，与癌旁组织、正常组织甲基化富集后的产物和第1一4轮RDA产物杂交。半定量Rl、PCR以G3PDH的表达作为内对照，采用RT一PCR方法检测差异甲基化序列相关基因Staufen在结直肠癌癌旁粘膜、腺瘤、腺癌以及相应远端切缘正常组织中的表达情况。免疫组织化学法用免疫组织化学法检测Staufen蛋白在结直肠癌癌旁粘膜、腺瘤、腺癌以及相应远端切缘正常组织的表达情况。数据统计分析用中位数和四分位间距(P25一氏)描述mRNA水平上相对表达水平;各组间在mRNA和蛋白水平上的表达比较采用配对(比)的秩和检验(两样本Wi.eoxon和多样本F五edlnan法)。第5页共97页浙江大学博十学位论文研究结果经MCA-RDA分析，获得33个非重复序列的差异甲基化片段。通过BLAST系统相似性分析，这些片段与相关基因的关系主要分为下面4类:(l)位于相关基因的5’端或第一外显子区域，共有6个序列符合这种分布。(2)位于相关基因的内含子或其它外显子区，有16个序列属于这一类型。(3)有9个序列在Genbank中找不到相关的基因。(4)还有2个序列在基因组中找不到与之匹配的位置。差异甲基化片段IA12与GR6基因、2F8zl与Staufen、一AOz与CECR7基因位置相关。在mRNA水平上，远端切缘正常结直肠组织Staufen的表达显著高于相应的癌旁粘膜、腺瘤和腺癌(p<0.05)。从正常组织、癌旁粘膜到腺癌staufen基因的表达呈降低趋势。免疫组化结果表明，正常组织与腺癌组织的Staufen蛋白的表达水平显著高于癌旁粘膜(p<0.05)，但正常组织与腺癌组织之间未发现有统计学差别(p>0.05)。从正常结肠组织、癌旁粘膜到腺癌，staufen蛋白的表达呈现先高后低再升高的趋势，即“V’’形变化曲线。

全文目录

一、缩略语  3-4
二、中文摘要  4-9
三、英文摘要  9-13
四、正文  13-91
  (一) 、前言  13-19
  (二) 、主要的仪器设备和试剂  19-25
  (三) 、第一部分甲基化CpG岛扩增法结合RDA筛选结肠癌差异的甲基化片段  25-61
    1 材料与方法  25-41
    2 结果  41-49
    3 讨论  49-61
  (四) 、第二部分 Staufen基因在结直肠腺癌以及相应的腺瘤、癌旁粘膜和正常组织中的表达  61-82
    1 材料与方法  61-66
    2 结果  66-76
    3 讨论  76-82
  (五) 、结论  82
  (六) 、参考文献  82-91
五、综述 DNA甲基化在肿瘤发生中的作用  91-96
六、在读期间发表的论文、参加的学术会议和获得的奖励  96-98
七、致谢  98

结直肠癌癌旁粘膜CpG岛异常甲基化的研究

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