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鸡传染性支气管炎病毒国内分离株基因组的研究

作　者: 刘玉芬
导　师: 刘宝全
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡传染性支气管炎病毒基因组分析进化树构建
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。其临床诊断特征为病鸡咳嗽，喷嚏，气管啰音；幼鸡流鼻涕，蛋鸡产蛋量及蛋品质下降。各日龄、品种和性别的鸡均易感。目前，在我国IB的发生已经遍布华北、华南、西北、西南和东北等大部分省、市和自治区，虽然已广泛使用IB疫苗，但IB的发生仍然普遍存在，尤其是在已免疫鸡群中又常常爆发IB，给养殖业造成严重的经济损失。IBV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的代表种。其基因组为单股线状正链RNA’，有感染性，大小约为27.6kb，具有3′poly A尾和5′帽状结构(cap)。在感染细胞内可检出6种亚基因组mRNAs(1-6)，现已确定mRNA 2、4、6分别编码IBV的3个主要结构蛋白——纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid．N)；而mRNA1包含两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，即ORF1a和ORF1b，可编码440KD和300KD的蛋白。但在通常情况下，下游的ORF1b可通过核糖体移框(Frameshifting)与上游的ORF1a形成分子量约为750KD的多聚蛋白(Polyprotein)pplab，然后再被细胞内蛋白酶裂解为相应的功能蛋白。本研究主要对已经分离鉴定的三株IBV毒株LH2／01／10(黑龙江肾型株)、D971(大连“腺胃型”株)和LX4(新疆肾型株)进行基因分析。首先在10龄SPF鸡胚中增殖病毒，当病毒尿囊液血凝价稳定在256以上时，纯化和浓缩病毒，再经反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术扩增目的基因。本研究首先对三株毒株的主要结构基因进行了克隆和序列测定。设计引物时将5a、5b和N基因，3a、3b、3c与M同时扩出。构建了结构基因N、M、S和3c(E)和非结构基因3a、3b、5a和5b的基因进化树。序列测定表明三者的N基因均由1230bp组成，无碱基的缺失与插入，但存在点突变，编码409个氨基酸(AA)，且与国内分离株同源性均较高，而在某些基因区与H120和H52同源性可达100％。N基因进化树显示LH2／01／10、LX4在同一群内，而D971却与国外参考毒株更近，表明三者在不同地区经历不同的进化，导致不同基因特征的出现。M基因长度不同，LH2／01／10为687bp(228个AA)、D971为681bp(226个AA)、LX4 678bp(225个AA)，M基因保守程度也较高，进化树表明三者亲缘关系与国内毒株近，与国外毒株及疫苗株相对较远。S蛋白是IBV最重要的免疫原，尤其S1部分可刺激机体产生保护性的中和抗体，而S1基因在基因组中变异频率最高。S基因序列分析表明，LH2／01／10与LX4的S基因为3495bp，编码1164个AA，S蛋白的切割识别位点为5个连续的碱性氨基酸残基组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(His-Arg-Arg-Arg-Arg，HRRRR)，为IBV中国分离毒株所独有。二者的S1基因均为1614bp，编码539个AA；D971S为3498bp，编码1165个AA，切割识别位点为NSRRR，该序列为所选参考毒株中最为独特的一个。D971S1为1614bp，编码538个AA，S2为1884bp，编码627个AA。S1基因分析表明不同国家的IBV毒株差异显著，LH2／01／10与LX4在同一群内，与H120和H52等疫苗株相对较近，而与国外东北农业大学农学博士学位论文变异株D1466和DEO72等群仅36%同源。D971独树一帜，与国外参考毒株相近，这再次证明D971的独特进化史。E基因是近年来研究发现的IBV的另一个结构基因，LHZ/0l/1 oE基因为336bp，0971为309bp，Lx4为330bp，三者均表现在3’端变异频繁，与参考毒株一致。进化树分析表明，LHZIO 1/10与Lx4在同一大群内，而D971却远离大部分参考毒株，与上述sl基因的进化结果一致. 非结构基因3a、3b、5a和5b的序列结果表明，三者的5a和5b基因数目分别一致.sa均为198bP，编码65个AA，sb为249bp，编码82个^^。3a基因二者也相同，为174bp，编码57个^^。LHzlo一/lo3b为x89bP，编码62个AA;o9713b为195bp，编码64个AA;LX43b为192bP，编码63个AA，在第60位LH功1/10与Lx4均缺少D。3a基因分析表明LX4进化独特，单列一个分支，而D971与国外变异株GA/98相近，LHZ/0 1/10与BJ亲源关系近。3b基因进化树与sl和3c一致。5a和5b进化关系一致，参比的国内毒株在同一群内。 LX4 mRNA 15’端独特区序列测定使该毒株成为国内首次完成全基因序列测定的IBV地方分离株.LX4 mRNAI由19940bp组成，包含2个ORF，即ORFla和ORFlb。其中LX4 ORFla为11916个by，编码3971个AA.LX40RFlb为7950bp，编码2649个AA。在LX40RFla和ORFlb之间有74bp间隔.具有与Beaudette毒株相同的“滑脱序列”竹TAAAC，保证聚合蛋白pPlab的形成。LX4“假结”的第2环第7位与Beaudette相比，由G突变为A，但基本结构不变，不影响该区域的功能。综上所述，本研究分析了三株毒株结构基因N、M、sl和E基因的变异特征，同时也对非结构基因3a、3b、3c、5a和sb基因进行了国内的首次构建分析。Lx4的全基因序列的测定是国内首次对工BV地方分离株的?

全文目录

中文摘要  8-10
外文摘要  10-13
1 引言  13-31
  1.1 鸡传染性支气管炎研究进展  13-20
    1.1.1 鸡传染性支气管炎概述  13
    1.1.2 鸡传染性支气管炎病原学研究  13-17
    1.1.3 流行病学、临床症状和病理学研究  17-18
    1.1.4 诊断  18-20
    1.1.5 免疫预防  20
  1.2 鸡传支病毒的分子生物学研究进展  20-29
    1.2.1 IBV的毒粒结构  20-21
    1.2.2 IBV基因组结构  21-22
    1.2.3 IBV基因组所编码的蛋白质  22-25
    1.2.4 IBV的复制机制  25-28
    1.2.5 IBV的变异机制  28-29
  1.3 结语  29-31
2 材料与方法  31-36
  2.1 材料  31-32
    2.1.1 毒株  31
    2.1.2 SPF鸡胚和SPF鸡抗凝血  31
    2.1.3 载体与受体菌  31
    2.1.4 引物  31
    2.1.5 分子生物学试剂  31
    2.1.6 主要仪器设备  31-32
  2.2 方法  32-36
    2.2.1 毒株的增殖与RNA的提取  32-33
    2.2.2 RT-PCR  33
    2.2.3 PCR产物的初步鉴定  33
    2.2.4 PCR片段的纯化回收  33-34
    2.2.5 PCR产物的连接  34
    2.2.6 感受态细胞的制备  34
    2.2.7 转化  34
    2.2.8 重组质粒的提取  34-35
    2.2.9 重组质粒的鉴定  35
    2.2.10 序列测定  35
    2.2.11 序列的比较分析  35-36
3 结果  36-99
  3.1 病毒血凝价的测定  36
  3.2 IBV毒株N基因分析  36-47
    3.2.1 LH2／01／10N基因分析  36-39
    3.2.2 D971N基因分析  39-42
    3.2.3 LX4 N基因分析  42-45
    3.2.4 5a、5b和N基因进化树分析  45-47
  3.3 IBV毒株M基因分析  47-59
    3.3.1 LH2／01／10M基因分析  47-50
    3.3.2 D971M基因分析  50-53
    3.3.3 LX4M基因分析  53-56
    3.3.4 3a、3b、3c和M基因进化树分析  56-59
  3.4 IBV毒株S基因分析  59-73
    3.4.1 LH2／01／10S基因分析  59-63
    3.4.2 D971S基因分析  63-68
    3.4.3 LX4S基因分析  68-72
    3.4.4 S1基因的遗传演化  72-73
  3.5 LX4mRNA1基因的分析  73-99
    3.5.1 LX4mRNA15端独特区的扩增、克隆与鉴定  73-78
    3.5.2 LX4mRNA1的分子特征  78-96
    3.5.3 LX4mRNA1ORF1a和ORF1b非结构蛋白分析  96-99
4 讨论  99-104
  4.1 IBV结构基因的遗传变异  99-101
  4.2 IBV非结构基因的分子特征  101
  4.3 LX4基因组的分析  101-104
5 结论  104-105
参考文献  105-113
附录  113-115
攻读博士期间发表的学术论文  115-116
致谢  116

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株基因组的研究

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