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Pseudomonas sp. WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的机理研究

作　者: 张俊杰
导　师: 周宁一
学　校: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
专　业: 微生物学
关键词: Pseudomonas sp. WBC-3 4-硝基酚代谢途径 4-硝基酚单加氧酶趋化质粒基因组分析
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

硝基芳香烃化合物是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等合成的前体。这类化合物能在环境中长期残留，已经对土壤、水体和大气造成了严重的污染。硝基芳香烃化合物能影响人体的物质代谢，有致癌、致畸和致突变等危险，严重威胁着人类的健康和生存。苯环结构的对称性和稳定性使硝基芳香烃化合物不易发生化学反应，而环境中的许多微生物却能够利用这些污染物作为唯一的碳源、氮源和能源来生长，能把这些污染物完全降解。微生物的这一特性使其在污染物的生物治理和生物修复中具有难以替代的优势，因而越来越受到人们的青睐。同时，对这些微生物的代谢途径和代谢基因的研究也成为本领域研究的热点。本论文的研究工作分为以下三个部分。第一部分是Pseudomonas sp．WBC-3对4-硝基酚的代谢途径研究。WBC-3是一株能够利用甲基对硫磷(Methyl Parathion，MP)和4-硝基酚(4-Nitrophenol，4-NP or PNP)做为唯一碳源、氮源及能源生长的革兰氏阴性菌。WBC-3降解MP的第一步是在甲基对硫磷水解酶(Methyl parathionhydrolase，MPH)的作用下生成4-硝基酚，然后再由其它的酶系完成4-硝基酚的代谢。目前报道的4-硝基酚的代谢途径主要有两种，根据其中间代谢产物的不同分别称之为对苯二酚途径和1，2，4-苯三酚途径。对苯二酚途径主要存在于在革兰氏阴性菌中，而1，2，4-苯三酚途径则在革兰氏阳性菌中广泛存在。我们前期的研究结果表明革兰氏阴性菌WBC-3是经对苯二酚途径降解4-硝基酚。在该途径中，4-硝基酚首先被氧化为对苯二醌(Benzoquinone)，对苯二醌在还原酶作用下还原为对苯二酚(Hydroquinone)，然后进入下面的开环途径。对苯二酚在对苯二酚双加氧酶的作用下开环生成γ-羟基粘康酸半醛(γ-Hydroxymuconic semialdehyde，HMSA)，后者在脱氢酶作用下转化为马来酰乙酸(Maleylacetate，MA)。MA在MA还原酶作用下生成β-酮己二酸(β-ketoadipate)并最终进入三羧酸循环。目前唯一的与4-硝基酚代谢相关的基因及操纵子的报道来自于革兰氏阳性菌Rhodococcus opacus SAO101(Kitagawa et al，J Bacteriol，2004：4894)，该菌经1，2，4-苯三酚途径降解4-硝基酚。目前尚没有关于4-硝基酚经对苯二酚途径代谢的分子生物学研究的文献报道。本研究通过基因组步移的方法，成功地获得了4-硝基酚经对苯二酚途径代谢的完整的基因簇。序列比对结果表明，在14 kb长的片断中可能包括了参与4-硝基酚代谢的全部基因。其中pnpA编码4-硝基酚单加氧酶，pnpB编码对苯二醌还原酶，pnpC编码对苯二酚双加氧酶，而γ-羟基粘康酸半醛脱氢酶和马来酰乙酸还原酶分别由pnpD和pnpE编码。WBC-3的代谢基因簇可能属于3个不同的操纵子，其中pnpA和pnpB反向转录，负责上游代谢途径，pnpCDE组成下游代谢操纵子，在它们的上游有一个可能编码LysR家族调控蛋白的基因。本研究通过体外表达和基因敲除鉴定了WBC-3代谢4-硝基酚途径中的两个关键酶基因，即催化初始反应的4-硝基酚单加氧酶(para-nitrophenol monooxygenase，PNPMO)和催化开环反应的对苯二酚双加氧酶(Hydroquinone dioxygenase，HQDO)。pnpA编码的4-硝基酚单加氧酶能够在体外催化4-硝基酚氧化为对苯二酚并同时释放等当量的亚硝酸根离子。序列分析结果表明，4-硝基酚单加氧酶属于典型的黄素蛋白单加氧酶家族，它与现有的所有功能类似的单加氧酶没有明显的亲缘关系，在进化过程中形成一个独立的分支。pnpC编码的对苯二酚双加氧酶也是WBC-3降解4-硝基酚的必需基因，序列比对及进化分析结果表明该酶属于苯三酚1，2-双加氧酶家族。对4-硝基酚单加氧酶的酶学特性的研究结果表明，该酶的酶活需要FAD和NADPH作为辅因子，每转化一个分子的4-硝基酚需要消耗两个分子的NADPH。该酶底物特异性很强，仅能催化4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的氧化反应，其中4-硝基酚是该酶的最适底物。本研究是首次在分子生物学水平上研究4-硝基酚的对苯二酚代谢途径和代谢机理。与R．opacus SAO101的苯三酚代谢途径相比，WBC-3无论是代谢途径，酶和基因，还是代谢操纵子的结构特点都与之完全不同。第二部分是Pseudomonas sp．WBC-3对芳香烃化合物的趋化特性研究。微生物的趋化是指微生物个体朝向或者远离某种刺激物的运动，是对外界环境变化作出的迅速的反应。根据趋化与微生物代谢的关系可以将微生物的趋化分为代谢依赖型趋化和代谢不依赖型趋化。对于降解有机污染物的微生物来讲，趋化可能是细菌进化产生的一种选择优势，但是细菌的趋化特性及其在生物降解和生物修复中的作用目前仍没有引起足够的重视。本研究采用drop assay方法研究WBC-3的趋化特性，结果表明，WBC-3不仅能够对其可代谢物4-硝基酚、4-硝基邻苯二酚和对苯二酚产生趋化反应，而且对多种其不能降解或转化的芳香烃化合物也能产生趋化反应。此外，WBC-3的趋化是组成型表达的，是不依赖于代谢的趋化，代谢基因的敲除不影响它的趋化反应。WBC-3对芳香烃化合物的趋化可能属于β-ketoadipate控制的趋化系统，这种趋化系统在降解有机污染物的微生物中广泛存在，是在进化过程中微生物获得的一种选择优势。第三部分是Pseudomonas sp．WBC-3的降解质粒pZWLO的部分基因组生物信息学分析和注释。质粒作为可移动遗传元件(Mobile Genetic Elements，MGEs)的一种在微生物对环境污染物的适应性进化中起着关键的作用，许多代谢途径的基因簇都定位在质粒上。目前已有多个降解质粒的全基因组序列测定完成，通过对其进行比较分析不仅能直接获得代谢基因簇的全序列，而且还可以用来研究代谢基因的起源和进化，并为质粒的复制调控机理及其进化研究提供了材料。Pseudomonas sp．WBC-3中的甲基对硫磷水解酶(MPH)基因就定位在一个约70kb的质粒(pZWLO)上，本研究对已获得的该质粒的基因组序列进行分析和注释。结果表明，在已获得的序列中，主要是与质粒的复制、稳定传代和接合转移有关的核心基因。从复制蛋白的序列来看，质粒pZWLO可能属于IncP不相容组，但具体属于哪个不相容亚组还不明确。pZWL0中质粒核心基因的氨基酸序列与数据库中同类蛋白的序列一致性都不高，这说明pZWL0与现有的已知序列的降解质粒在进化中的亲缘关系较远。序列分析结果表明WBC-3的甲基对硫磷水解酶基因(mph)定位于一个典型的Ⅰ型转座子上(Tn-mph1)，而该转座子又是Ⅱ型转座子(Tn-mph2)的一部分。目前已知的两类有机磷水解酶(MPH和OPD)基因都定位在转座子上，这可能是它们在微生物中广泛存在的原因。进化分析结果表明二者起源于不同的祖先，经过独立的进化过程形成两种结构完全不同的同工酶。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-16
第1章引言——硝基芳香烃化合物的微生物代谢途径及机理研究  16-35
  1.1 硝基苯(Nitrobenzene)的代谢途径  18-20
    1.1.1 部分还原途径  19
    1.1.2 双加氧途径  19
    1.1.3 硝基苯下游代谢途径比较  19-20
  1.2 硝基苯甲酸(nitrobenzoates,NBA)的代谢途径  20-22
    1.2.1 2-硝基苯甲酸的代谢途径  20
    1.2.2 3-硝基苯甲酸的代谢途径  20-22
    1.2.3 4-硝基苯甲酸的代谢途径  22
  1.3 硝基甲苯(Nitrotoluene)的代谢途径  22-27
    1.3.1 2-硝基甲苯的代谢途径  22-23
    1.3.2 3-硝基甲苯的代谢途径  23
    1.3.3 4-硝基甲苯的代谢途径  23-24
    1.3.4 2,4-二硝基甲苯(2,4-dinitrotoluene,2,4-DNT)的代谢途径  24
    1.3.5 2,6-二硝基甲苯(2,6-dinitrotoluene,2,6-DNT)的代谢途径  24-25
    1.3.6 三硝基甲苯(2,4,6-trinitrotolene,TNT)的代谢途径  25-27
  1.4 硝基酚(Nitrophenol,NP)的代谢途径  27-31
    1.4.1 3-硝基酚的代谢途径  28
    1.4.2 2-硝基酚的代谢途径  28
    1.4.3 2,4,6-三硝基酚(2,4,6-trinitrophenol,TNP)的代谢途径  28-29
    1.4.4 二硝基酚(Dinitrophenol,DNP)的代谢  29-30
    1.4.5 有机磷农药的微生物降解  30-31
  1.5 芳香烃化合物代谢途径研究的趋向  31-32
  1.6 4-硝基酚(4-Nitrophenol,4-NP or PNP)的代谢途径研究进展  32-34
    1.6.1 4-硝基酚的代谢途径  32-34
    1.6.2 4-硝基酚代谢途径的分子生物学研究  34
  1.7 本研究目的和意义  34-35
第2章材料和方法  35-41
  2.1 培养基  35
  2.2 菌株及其培养方法  35
  2.3 工具酶和试剂  35
  2.4 分子生物学实验方法  35-38
    2.4.1 常规分子生物学方法  35
    2.4.2 染色体DNA制备  35
    2.4.3 基因组步移(Genomic walking)  35-36
    2.4.4 Pseudomonas sp.WBC-3菌中的基因敲除  36-38
  2.5 酶活测定(Enzyme Assay,cell free assay)  38-39
  2.6 生物转化(Biotransformation,resting cell assay)  39
  2.7 分析方法  39
    2.7.1 HPLC检测  39
    2.7.2 蛋白浓度测定  39
    2.7.3 亚硝酸根的测定  39
  2.8 趋化试验  39-40
  2.9 DNA序列测定及分析  40
  2.10 WBC-3的质粒pZWL0的全基因组序列测定及分析  40-41
第3章 Pseudomonas sp.WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的代谢途径及代谢机理研究  41-61
  3.1 WBC-3菌株降解4-硝基酚的代谢途径研究  41-44
    3.1.1 WBC-3菌株4-硝基酚单加氧酶的酶活测定  41-42
    3.1.2 WBC-3菌株对苯二酚双加氧酶的酶活测定  42-44
  3.2 对苯二醌还原酶基因的克隆  44
  3.3 基因组步移法克隆4-硝基酚代谢基因簇  44
  3.4 4-硝基酚代谢基因簇的生物信息学分析  44-49
  3.5 4-硝基酚单加氧酶的功能验证及酶学特性研究  49-51
    3.5.1 pnpA在E.coli中的表达  49
    3.5.2 生物转化法测定PnpA的活性  49-50
    3.5.3 4-硝基酚单加氧酶的酶活测定  50
    3.5.4 4-硝基酚单加氧酶的酶学特性研究  50-51
      3.5.4.1 辅因子对4-硝基酚单加氧酶酶活的影响  50
      3.5.4.2 4-硝基酚单加氧酶氧化4-硝基酚和NADPH的比例  50-51
      3.5.4.3 4-硝基酚单加氧酶的底物范围测定  51
      3.5.4.4 4-硝基酚单加氧酶对4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的比活测定  51
  3.6 对苯二酚双加氧酶的功能验证  51-52
  3.7 基因敲除验证 4-硝基酚代谢关键酶基因  52-53
  3.8 讨论  53-61
    3.8.1 4-硝基酚单加氧酶属于典型的黄素蛋白单加氧酶家族  53-55
    3.8.2 对苯二醌还原酶基因在 4-硝基酚代谢途径中的作用  55-56
    3.8.3 对苯二酚双加氧酶的酶学特点  56-58
    3.8.4 WBC-3菌株中 4-硝基酚代谢操纵子的研究  58-59
    3.8.5 4-硝基酚两种代谢途径的比较  59-61
第4章 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究  61-76
  4.1 引言——微生物的趋化机理及其在环境污染物降解中的作用  61-69
    4.1.1 微生物趋化的概念  61
    4.1.2 微生物趋化的机理  61-62
    4.1.3 趋化与微生物代谢的关系  62-63
    4.1.4 细菌对简单芳香烃的趋化  63-64
    4.1.5 细菌对萘的趋化研究  64-65
    4.1.6 细菌对硝基芳香烃化合物的趋化  65
    4.1.7 趋化在微生物降解有机污染物中的作用  65-68
    4.1.8 本研究的目的及意义  68-69
  4.2 实验结果  69-71
    4.2.1 Pseudomonas sp.WBC-3对其可代谢芳香烃化合物的趋化  69
    4.2.2 Pseudomonas sp.WBC-3对其非代谢芳香烃化合物的趋化  69-70
    4.2.3 Pseudomonas sp.WBC-3代谢突变株的趋化特性  70-71
    4.2.4 Pseudomonas sp.WBC-3对甲基对硫磷的趋化  71
  4.3 讨论  71-76
    4.3.1 WBC-3对芳香烃化合物的趋化是不依赖于代谢的趋化  71
    4.3.2 WBC-3对芳香烃化合物的趋化属于β-ketoadipate控制的趋化系统  71-72
    4.3.3 β-ketoadipate趋化系统在土壤微生物中广泛存在  72-73
    4.3.4 微生物对芳香烃化合物趋化机制的研究进展  73-74
    4.3.5 WBC-3对甲基对硫磷的趋化  74
    4.3.6 趋化研究方法的进展  74-76
第5章 Pseudomonas sp.WBC-3 甲基对硫磷降解性质粒pZWL0的全序列分析  76-89
  5.1 WBC-3质粒pZWL0的全序列测定及分析  77
  5.2 甲基对硫磷水解酶基因(mph)定位在转座子上  77-83
    5.2.1 转座子的分类及结构特点  77-83
    5.2.2 mph转座子的结构特点。  83
  5.3 有机磷水解酶的起源和进化  83-86
    5.3.1 有机磷水解酶的分类  83
    5.3.2 有机磷水解酶的转座子定位  83-84
    5.3.3 有机磷水解酶的进化分析  84-85
    5.3.4 有机磷水解酶的起源与进化历程  85-86
  5.4 WBC-3质粒pZWL0中与质粒复制、传代有关的基因  86-87
  5.5 WBC-3质粒pZWL0中与质粒接合转移相关的基因  87
  5.6 WBC-3质粒pZWL0中的其它功能未知基因  87
  5.7 WBC-3质粒pZWL0的基因组织结构特点  87-88
  5.8 结论  88-89
第6章结论和进一步工作设想  89-91
  6.1 结论  89-90
    6.1.1 Pseudomonas sp.WBC-3中4-硝基酚的代谢途径研究  89
    6.1.2 Pseudomonas sp.WBC-3的趋化特性研究  89-90
    6.1.3 Pseudomonas sp.WBC-3的质粒pZWL0序列分析  90
  6.2 进一步工作设想  90-91
参考文献  91-105
发表与待发表文章目录  105-106
致谢  106

Pseudomonas sp. WBC-3菌株分解代谢4-硝基酚的机理研究

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