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杯伞（Clitocybe sp.）AS 5.112胞外多糖发酵、生物活性及结构分析

作　者: 王允祥
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 食药用真菌 杯伞 深层发酵 血象分析 高效凝胶过滤色谱 甲基化分析
分类号: TS201
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


食药用真菌作为药物，在我国已有几千年的历史，其中所含有的生物活性物质，尤其是多糖类物质，作为增强人体免疫功能的生物反应调节剂更是为人们所熟知。如今，食药用真菌已成为现代医学寻找具有抗肿瘤和免疫增强功能新药的一个重要源泉。鉴于此，我们对牛肝菌（Boletus sp.）ACCC 50328、翅鳞伞（Pholiota squarrosa）AS5.245和杯伞（Clitocybe Sp.）AS 5.112的深层发酵技术与抗肿瘤效应进行了筛选研究，以期了解它们胞外多糖类物质的生理活性。 本文重点报告了对抗肿瘤活性较强的杯伞（Clitocybc sp.）AS 5.112深层发酵优化、胞外多糖生理活性、分离纯化及其构效关系所进行的系统研究，主要研究结果如下： 1．采用Plackett-Burman设计法，对影响杯伞菌丝生长以及发酵产糖的诸多因素进行了研究和探讨，所选取的20个相关因素为葡萄糖、果糖、麦芽糖、酵母膏、胰蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、NaNO3、FeSO4、MgSO4、MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuSO4·5H2O、维生素B1、起始pH、发酵温度、时间和装液量。结果表明，对杯伞（Clitocybe Sp．）AS 5.112菌丝生长量具有显著影响的因子是葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、FeSO4、MgSO4、FeCl3、起始pH、发酵温度和时间，而对其发酵产糖有显著影响的因素为葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、K2HPO4、NaNO3、维生素B1和装液量。 2．在Plackett-Burman实验基础上，通过全因子中心组合设计（Full-Factorial Central Composite Design，CCD）法分别建立了杯伞菌丝生长与胞外多糖对发酵培养基关键组成成分的二次多项数学模型，并利用统计学方法以及后续试验对该模型进行了显著性检验和有效性验证。借助模型方程的响应面图及其等高线图，对关键影响因素间的交互作用进行了深入的研究与探讨，分析得出了各关键营养要素的合适浓度水平范围，即在葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、NaNO3和MgSO4的浓度分别是(g·L-1)14.00～17.15、4.10～6.00、1.63～2.40、2.00～3.25和0.92～1.60时，每毫升发酵醪所能获得的胞外多糖含量可达1045.52μ以上；而在上述各因子分别为(g.L-1)19.30～24.00、3.00～4.52、1.00～2.06，2.00～3.02和1.41～1.60的条件下，每毫升发酵醪可获得不低于6.63mg的菌丝量。分别对胞外多糖模型方程与生长模型方程解逆矩阵求得：在葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、NaNO3和MgSO4分别为(g·L-1)14.00，5.11，2.07，2.00和1.28时，每毫升发酵醪中的胞外多糖最大预测值为1081.80μg；而在24.00，3.23，杯伞（aitocybe sP.）As 5.112胞外多糖发酵、生物活性及结构分析1 .52，2.36和1，60时，每毫升发酵醛可获得的最大菌丝量预测为6.81 mg。通过对两方程的联合求解可同时获得1011.30产gml一’的胞外多糖和6.66 mgml一’的菌丝量，此时发酵培养基的组成为葡萄糖21 .749、酵母膏4.339、胰蛋白陈1 .659、NaNo3 2.459、Mgso41.50g、KZHpo4o.sog、KHZPo;0.509、Feso;100 mg、Feel35omg、维生素Bl 50mg、蒸馏水1000 ml、起始pH 7.0，此预测可信度不仅被统计分析所验证，也被实践所证实。 3.在Plackett-Burrnan和CCD实验基础上，采用Box一Behnken统计学实验设计方法对影响杯伞菌丝生长及发酵胞外多糖的3个关键外界影响因素发酵温度、时间和装液量的最佳水平范围及其交互作用进行了研究与探讨.通过对模型方程3一D图及其等高线图研究发现，在发酵温度为24.3oC一25.8oC、发酵时间为9.7d一10.2d和装液量为76.0 ml一90.0 ml的工艺条件下，每毫升发酵醛可获得1252.30产g以上的胞外多糖;而在发酵温度为23.soe一24.soe、发酵时间为9.6d一lo.3d和装液量为7x.Oml一98.0ml范围内，每毫升发酵醛可获得8.犯mg的菌丝生长量。分别对胞外多糖二次多项数学模型方程与菌丝生长模型方程解逆拒阵得知:在发酵温度、时间和装液量分别为Zs.ooe、9.9d和53.4 ml时，杯伞胞外多糖的最大预测值为1265.45尸g·ml‘’发酵醛，在上述自变量分别为24.4oc、9.9d和87.lml时，该菌菌丝浓度可达8.50 mgml一，发酵醛;如欲同时获得最大胞外多糖量和菌丝生长量，通过对上述两方程的联合求解得知，在发酵温度、时间和装液量分别为24.5oC、9.9d和84.7ml的条件下，每毫升发酵醛即可同时获得1261.60产g的胞外多糖和8.47mg的菌丝量。 4.小鼠体内研究表明，杯伞胞外多糖对肉瘤 518。具有抑制作用，其最佳剂量为100 mgkg一，·d一’，抑瘤率为52.4%;荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数也显著地增加，分别从2.76升至3.88和6.73升至10.巧;杯伞胞外多糖与杭肿瘤药物丝裂霉素C之间不存在协同抑制小鼠肉瘤S，8。的作用，单独腹腔注射杯伞胞外粗多糖比两者联用更能有效地刺激脾器官的反应，增强小鼠的免疫功能。 5.杯伞胞外多糖灌喂正常小鼠，其胸腺指数和脾指数变化显著，分别从（mg·gbody w.t一，）2.64和6一9增至3.25和5.25，但量效之间不存在线性关系:对小鼠的始、终重量、脏器指数和相对生长率皆无明显的影响。 6.血象分析表明，杯伞胞外多糖250 mgkg一’·d一‘剂量能显著地将正常小鼠白细胞总数和?

全文目录


中文摘要  8-11
英文摘要  11-16
缩写符号  16-18
表格索引  18-21
图形索引  21-25
前言  25-27
第1章 食药用真菌多糖研究  27-66
  1.1 文献综述  27-46
    1.1.1 食药用真菌多糖研究现状  29-44
    1.1.2 食药用真菌多糖研究展望  44-46
  1.2 本文研究概述  46-51
    1.2.1 食药用真菌发酵法筛选研究  46-48
    1.2.2 食药用真菌胞外粗多糖生理活性研究  48-49
    1.2.3 杯伞(Clitocybe sp.)AS 5.112胞外多糖分离纯化研究  49-50
    1.2.4 杯伞(Clitocybe sp.)AS 5.112胞外多糖组成及结构分析  50-51
  参考文献  51-66
第2章 杯伞生长与发酵胞外多糖主要影响因子的筛选  66-74
  2.1 材料与方法  66
    2.1.1 供试菌株  66
    2.1.2 培养基  66
    2.1.3 菌种培养及接种  66
    2.1.4 菌丝生长量与胞外多糖含量测定  66
  2.2 实验设计  66-68
  2.3 结果与讨论  68-72
    2.3.1 杯伞菌丝生长关键影响因子的确定  69-71
    2.3.2 杯伞发酵胞外多糖关键影响因子的确定  71-72
  本章小结  72-73
  参考文献  73-74
第3章 杯伞深层发酵培养基优化研究  74-89
  3.1 材料与方法  74-75
    3.1.1 供试菌株  74
    3.1.2 培养基  74
    3.1.3 发酵培养基配制  74
    3.1.4 菌种培养及接种  74
    3.1.5 菌丝生长量与胞外多糖含量测定  74-75
  3.2 实验设计  75-78
  3.3 结果与讨论  78-86
    3.3.1 模型建立与显著性检验  78-80
    3.3.2 胞外多糖含量响应面分析与优化  80-83
    3.3.3 菌丝生长量响应面分析与优化  83-85
    3.3.4 模型验证实验  85-86
  本章小结  86-87
  参考文献  87-89
第4章 杯伞深层发酵工艺研究  89-100
  4.1 材料与方法  89-90
  4.2 实验设计  90-91
  4.3 结果与讨论  91-98
    4.3.1 胞外多糖含量响应面分析与优化  94-95
    4.3.2 菌丝生长量响应面分析与优化  95-97
    4.3.3 模型验证实验  97-98
  本章小结  98
  参考文献  98-100
第5章 杯伞胞外粗多糖抗肿瘤及免疫学研究  100-111
  5.1 材料与方法  100-101
    5.1.1 供试材料  100
    5.1.2 实验方法  100-101
  5.2 评价指标及数据分析  101
  5.3 结果与讨论  101-109
    5.3.1 胞外粗多糖及其与丝裂霉素C联合抗肉瘤S180实验  101-107
    5.3.2 胞外粗多糖对正常小鼠血象及脏器指数的影响  107-109
  本章小结  109
  参考文献  109-111
第6章 杯伞胞外多糖分离纯化  111-126
  6.1 实验材料  111
    6.1.1 供试菌种  111
    6.1.2 发酵培养基  111
  6.2 实验方法  111-113
    6.2.1 工艺流程  111
    6.2.2 深层发酵  111
    6.2.3 醪液过滤  111
    6.2.4 醇沉条件优化  111-112
    6.2.5 脱蛋白最优条件确立  112-113
  6.3 结果与分析  113-123
    6.3.1 醇沉条件响应面分析与优化  113-118
    6.3.2 脱蛋白条件优化  118-123
  本章小结  123-124
  参考文献  124-126
第7章 杯伞胞外多糖分子结构研究  126-137
  7.1 材料与方法  126-128
    7.1.1 实验材料  126
    7.1.2 实验方法  126-128
  7.2 结果与讨论  128-135
    7.2.1 胞外多糖纯化及纯度鉴定  128-129
    7.2.2 胞外多糖分子量测定  129-130
    7.2.3 胞外多糖组成分析  130-132
    7.2.4 胞外多糖红外光谱分析  132
    7.2.5 胞外多糖甲基化分析  132-135
  本章小结  135-136
  参考文献  136-137
全文结论  137-139
创新摘要  139-140
致谢  140-141
在读期间已发表与录用论文  141

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学
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