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尾静脉液压法基因转移系统的建立及应用

作　者: 贺晨霞
导　师: 薛京伦
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 基因转移系统液压法尾静脉 Ⅰ型糖尿病糖尿病小鼠小鼠肝脏注射液体高效转移 hFIX DNA注射
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
下　载: 59次
引　用: 2次
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内容摘要

(一) 尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达，本文首先以凝血因子Ⅸ(hFIX)为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒转移体系。hFⅨ表达质粒pCMV-hFIX 2.2ml 7秒内注射到小鼠体内，hFIX在小鼠体内高水平表达，注射后1天平均为2.5μg／ml血浆，此后开始逐渐下降。PCR检测发现小鼠多种器官中存在hFIX cDNA，RT-PCR和免疫组化切片检测表明hFIX mRNA和蛋白主要在肝脏中表达。转氨酶水平与病理切片检测表明注射1天后5％的肝脏细胞受到损伤，但在3天至10天内完全恢复。实验进一步研究了影响液压法体内基因转移效率的各种影响因素，如DNA注射剂量、二次注射效果、注射液体积、注射速度、DNA溶液类型、小鼠生理状态(麻醉与否)、小鼠性别与晶系等。结果表明hFIX的表达量与DNA注射剂量呈正相关，但二次注射后表达水平降低。注射液体积为2.5ml以及注射速度为5秒时可高效将DNA转移到小鼠肝脏中并得到hFIX的高水平表达。Ringer’s作为注射液比PBS和生理盐水溶液更有利于hFIX的高效表达。雄性小鼠表达量优于雌性小鼠。ICR品系小鼠表达量高于C57品系。这些条件的研究对于尾静脉液压法介导基因转移的广泛应用具有重要的意义。 (二) Ⅰ型糖尿病治疗中胰岛素基因转移和表达是提高血糖控制的重要策略。尾静脉液压法可将裸DNA高效转移到小鼠肝脏中，本文研究了这种快速尾静脉注射法介导的肝脏胰岛素表达对Ⅰ型糖尿病血糖控制的恢复效果。遗传工程改造后的胰岛素cDNA插入EMV启动子驱动表达的质粒中，通过尾静脉液压法注射到STZ诱导的Ⅰ型糖尿病模型小鼠体内，检测小鼠体重变化、胰岛素水平、肝脏免疫组化、胰岛素DNA和mRNA等，同时也研究了质粒注射后糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。实验还采用了转座元系统来延长肝脏中胰岛素的表达。结果质粒注射后糖尿病小鼠血液中胰岛素水平显著升高，肝脏呈胰岛素免疫学阳性，同时高血糖有关症状得到改善，如血糖正常化、葡萄糖耐受能力改善、体重减复旦大学博士论文2少症状改善等等。没有糖尿病小鼠死于尾静脉快速注射过程。我们的结果表明胰岛素基因可以通过尾静脉高压注射高效转移到糖尿病小鼠肝脏中，获得高水平表达。尾静脉液压法介导的肝脏基础胰岛素表达可显著提高I型糖尿病的血糖控制，改善糖尿病症状。液压法是I型糖尿病基因治疗研究的方便而有效的基因转移途径。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
第一部分尾静脉液压法介导的人凝血因子Ⅸ基因在小鼠肝内的高效表达及其影响因素的研究  7-38
  材料与方法  9-16
  结果  16-30
  讨论  30-33
  小结  33-35
  参考文献  35-38
第二部分尾静脉液压法介导的胰岛素基因在糖尿病小鼠肝脏中的高水平表达及其治疗效果  38-68
  材料与方法  43-52
  结果  52-61
  讨论  61-63
  小结  63-64
  参考文献  64-68
综述  68-80
致谢  80-82

尾静脉液压法基因转移系统的建立及应用

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