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抗真菌生物农药—凯地菌素的研究

作　者: 刘秋
导　师: 吴元华
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 农用抗生素凯地菌素菌种鉴定原生质体融合发酵条件分离纯化作用机制田间防效
分类号: TQ450
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

本文针对植物真菌病害研究开发出了新型农用抗生素-凯地菌素。从菌种的筛选鉴定、原生质体融合、发酵条件的优化、活性组分的分离、理化性质及类型确定、田间防效等几个方面进行了系列研究，结果如下： 1、通过广泛筛选，获得了具有自主知识产权的生防菌株SY20-2和SY20-4。利用稀释分离法从全国13个地区37份样品的土壤中共分离到各种链霉菌菌株686份，采用活体平板测定法共获得对植物病原真菌具有拮抗作用的链霉菌菌株19份；采用杯碟法测定筛选的各菌株发酵液抑菌活性，其中发酵液抑菌圈直径超过15mm的菌株有5个。其中优势菌株SY20—2、SY20-4，无论其活体还是其发酵液对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌抑制率均接近或超过90％。同时二者对植物病原细菌也具有很好的抑菌活性。 2、利用传统分类法明确了菌株SY20—2、SY20—4的分类地位。通过对菌株SY20-2、SY20-4的形态特征、培养特征、生理生化特性、培养条件和拮抗性研究，明确了SY20-2、SY20-4分别属于灰褐类群中的产色链霉菌（Streptomyces chromogenes）和金色类群中的龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）的近源变种。 3、采用种间原生质体融合技术，获得了效价更高、抑菌谱更广的重组菌株。以菌株SY20—2及SY20—4作为出发菌株，利用二者在抗生素抗性上的差异，选择了卡那霉素（250ug／mL）、链霉素（1000ug／mL）和螺红霉素（150ug／mL）作为融合子的筛选标记。明确了出发菌株SY20-2、SY20-4原生质体产生及再生的最佳条件。以45％PEG作助溶剂，初筛原生质体融合频率为1.24％；复筛融合频率为0.124％；最后获得三个广谱、高效的重组菌株。 4、研究明确了菌株SY20-4最佳发酵条件，为凯地菌素进入中试阶段奠定了良好的基础。通过单因子试验，菌株SY20—4利用碳源产素从高到低依次为麦芽糖>蔗糖>糊精>淀粉>葡萄糖；利用氮源产素以花生饼粉和黄豆粉为最好，其它依次为玉米粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、（NH₄）₂SO₄。通过均匀试验设计，对菌株SY20-4发酵条件的相关方程进行回归分析，其发酵培养基的最佳配方为淀粉3.36％，花生饼粉1.733％，（NH₄）2SO₄0.23％，CaCO₃0.175％，NaCl0.2％。选用最优化的培养基配方，菌株SY20—4的最佳发酵条件为25℃，150r／min，10％的接种量，起始pH值为4，发酵培养144h，菌株SY20—4产素最多。凯地菌素整个发酵过程中总糖、总氮的含量逐渐减少，但碳源的利用率要明显高于氮源。 5、分离获得了凯地菌素的纯品并明确其类型，确定了凯地菌素为一四烯类新型农用抗生素。采用Doskochilova溶剂系统、pH纸层析和纸电泳，分析认为凯地菌素属于中性抗生素。选用溶媒革取法和大孔树脂静态吸附法分离凯地菌素，得到凯地菌素的粗品，采用硅胶层析板法，得到凯地菌素淡黄色晶体纯品。经高压液相色谱分析，测定提取的凯地菌素纯度可达引％。将凯地菌素纯品经紫外分析，其吸收峰与典型的四烯类物质吸收峰极为相近，因此，可初步判断凯地菌素可能为四烯类抗生素。凯地菌素在中性及偏碱性的条件下稳定，室温条件下存放半年活性开始下降，存放1年其活性丧失过半；凯地菌素对光稳定，54℃15天凯地菌素的抑菌活性基本与对照相同。凯地菌素对多种植物病原真菌及细菌都表现显著的抑制效果。采用扩散法和比色法来估计发酵液中抗生素的效价，认为比色法用来测定凯地菌素的估计效价是快速准确的，可以在以后的生产上广泛使用。 6、对凯地菌素抗菌作用机制进行了研究。明确了凯地菌素对番茄叶霉病菌同时具有抑菌和杀菌功能。凯地菌素对叶霉病菌的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度分别为 10fig／ffiL、25fig／ffiL。用凯地菌素处理的叶霉病菌菌丝表面形成许多瘤状物，同时细胞膜模糊，原生质体外渗。而紫外分光光度法测定进一步证明了凯地菌素的作用位点在病菌的细胞膜上，从而引起病菌细胞膜透性增加，引起核酸大分子物质外渗。凯地菌素在ZoUg／ffiL浓度时，即完全抑制叶霉病菌抱子的萌发。凯地菌素对番茄及番茄叶霉病菌作用的电镜观察表明，用凯地菌素处理番茄植株，能够使细胞周围沉积大量的电子致密物质，同时该电子致密物质出现的较接种出现的时间要早且多，同时番茄叶组织内的菌丝生长迟缓，说明凯地菌素在植物体内也具有抑菌功能：凯地菌素引起番茄主要防御酶系即超氧化物歧化酶门OD＊过氧化氢酶(CAT＊多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、p－l，3葡聚糖酶活性均在喷药后3—7d升高，说明凯地菌素不仅具有直接的杀菌作用，还可通过诱导植株防御酶系活性的增加而提高植株的抗病性。 7、凯地菌素田间防效试验证明，凯地菌素是一个具有广阔市场前景的“新型农用抗生素。在离体条件下，凯地菌素的有效中浓度为＊hd29．66U针mL，，。在番茄植株上施药 7d的有效中浓度为 ECto叫4．6ug／mL。在番茄植株上凯地菌素的有效中浓度明显小于离体条件下的有效中浓度，这与凯地菌素诱导番茄各防御酶系增强的时间相吻合，进一步说明，喷施凯地菌素能够诱导番茄抗病性增强。经过凯地酉素与部分

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中文摘要  9-11
前言  11-12
第一章文献综述：抗真菌农用抗生素的研究进展  12-44
  1 抗真菌农用抗生素的筛选途径  12-23
  2 抗真菌农用抗生素的主要组分、结构  23-29
  3 抗真菌农用抗生素的作用机理  29-33
  4 抗真菌农用抗生素的应用现状  33-39
  5 抗真菌农用抗生素研究存在的问题及开发动向  39-44
第二章抗真菌链霉菌菌株的筛选  44-52
  1 材料与方法  44-46
  2 结果与分析  46-50
    2．1 链霉菌菌株的分离  46
    2．2 目的生防菌的筛选  46-50
  3 结论与讨论  50-52
第三章 SY20-2和SY20-4链霉菌菌株的鉴定  52-65
  1 材料与方法  52-56
  2 结果与分析  56-63
    2．1 形态特征  56-57
    2．2 培养特征  57-61
    2．3 生理生化特性  61-63
    2．4 拮抗性  63
    2．5 培养条件  63
    2．6 菌种的鉴别  63
  3 结论与讨论  63-65
第四章菌株SY20—2与菌株SY20—4的种间原生质体融合  65-85
  1 材料与方法  65-69
  2 结果与分析  69-81
    2．1 抗药性标记的筛选  69-72
    2．2 菌丝体的培养  72-75
    2．3 原生质体制备  75-77
    2．4 原生质体再生  77-79
    2．5 原生质体融合  79-81
  3 结论与讨论  81-85
第五章菌株SY20—4摇瓶发酵条件研究  85-104
  1 材料与方法  85-90
  2 结果与分析  90-101
    2．1 单因子对SY20—4菌株产素的影响  90-93
    2．2 均匀设计试验  93-97
    2．3 培养条件对SY20-4菌株产素的影响  97-101
    2．4 发酵过程中的代谢变化  101
  3 结论与讨论  101-104
第六章凯地菌素的分离纯化及类型分析  104-128
  第一节凯地菌素的分离纯化  104-121
    1 材料与方法  104-109
    2 结果与分析  109-119
      2．1 发酵液的预处理  109
      2．2 凯地菌素的分离纯化  109-115
      2．3 凯地菌素理化性质  115-119
    3 结论与讨论  119-121
  第二节凯地菌素的类型分析及发酵液估计效价测定  121-128
    1 材料与方法  121-122
    2 结果与分析  122-126
      2．1 凯地菌素的类型分析  123-124
      2．2 发酵液中凯地菌素估计效价的测定  124-126
    3 结论与讨论  126-128
第七章凯地菌素的作用机制研究  128-143
  1 材料与方法  128-132
  2 结果与分析  132-141
    2．1 凯地菌素对番茄叶霉病菌的影响  132-134
    2．2 凯地菌素对番茄及番茄叶霉病菌作用的电镜观察  134-138
    2．3 凯地菌素对番茄主要防御酶系的影响  138-141
  3 结论与讨论  141-143
第八章凯地菌素的田间药效试验  143-151
  1 材料与方法  143-145
  2 结果与分析  145-150
    2．1 凯地菌素对番茄叶霉病菌的毒力测定  145-146
    2．2 室内抑菌试验  146-147
    2．3 菌株SY20-4发酵滤液的田间防治试验  147-149
    2．4 作物安全性  149-150
  3 结论与讨论  150-151
参考文献  151-158
致谢  158-159
英文摘要  159-161
附录  161

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