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胶质细胞多巴胺反应基因克隆及其特征分析

作　者: 石军
导　师: 蔡文琴
学　校: 第三军医大学
专　业: 组织学与胚胎学
关键词: 多巴胺星形胶质细胞大脑抑制消减杂交退行性神经疾病 Northern杂交同源克隆原位杂交细胞转染流式细胞仪
分类号: R329.2
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

多巴胺（dopamine，DA，化学名3，4-羟基苯丙胺）是中枢神经系统主要的儿茶酚胺类神经递质，多巴胺参与控制机体运动、行为、情绪、摄食及内分泌调节等。在中枢神经系统所有的慢作用递质中，DA是长期以来受到最多关注的神经递质，主要原因是其与神经系统重大医学问题联系最为紧密。临床上常见疾病如帕金森氏病（Parkinson’s disease，PD）是中脑黑质DA能神经元的选择性退变所致，亨廷顿氏舞蹈病（Huntington’s chorea）是由于纹状体内DA投射神经元的损害，目前所有的精神分裂症（schizophrenia）治疗药物在本质上主要是以DA受体的拮抗剂起作用，注意力缺陷/过敏障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）的症状可用DA能神经调节药物得到极大缓解。药物可卡因、苯丙胺、阿片与尼古丁、酒精等通过调节DA神经传递而获得成瘾性。人们已越来越清楚地认识到，DA在人类身心健康中具有非常重要的生理作用。DA的研究也成为了当今神经科学中的前沿研究领域，为揭示人类思维和精神活动规律及其有关疾病的奥秘提供了可能的途径。尽管人们对DA的研究有广泛的兴趣，并且也取得了辉煌的成就，但目前对DA发生作用的细胞和分子机制仍不清楚。随着近年来细胞或分子水平研究的广泛开展，发现脑内除神经元以外胶质细胞也是DA作用的重要靶细胞。事实上，脑组织主要由神经元和胶质细胞共同构成，数量上胶质细胞与神经元比是10～50：1，胶质细胞占脑体积一半以上，已经表明胶质细胞在神经系统具有非常重要的功能。最早的实验发现脑组织胶质细胞的提取物有腺甘酸环化酶相关的DA受体，接着，发现DA可刺激皮质和纹状体，非脑干来源的培养星形胶质细胞CAMP积聚。进一步应用电生理和放射性配体结合自显影研究提示胶质细胞具有DA受体。我们应用pH］DA放射性受体分析法（r。山。reCeptofN11山ng SSS。y，R RARA）研究发现三个不同部位来源的星形胶质细胞具有5个不同的解离常数，表明胶质细胞分布广泛而且具有部位异质特性。近期的研究利用分子生物学技术如PCR和原位杂交，证实培养纹状体胶质细胞表达DI和DZ受体。另外，胶质细胞具有类似神经元的DA摄取系统。由此可见，胶质细胞是脑内DA作用的重要靶细胞，并且胶质细胞可能在DA神经系统疾病中具有非常重要的作用。本研究利用细胞与分子生物学的多种技术方法，克隆与鉴定系列胶质细胞DA的相关基因，并对部分新基因功能进行初步的特性分析。一方面，从理论上有利于分析DA作用于星形胶质细胞的分子机制，了解胶质细胞在＊A神经系统中的生理功能：另一方面，可能获得＊A系统疾病的相关基因，对揭示帕金森氏病，精神分裂症和药物成瘸等疾病的病因，提高临床诊断以及治疗水平有重要的应用价值。本研究首先从大鼠脑组织分离培养星形胶质细胞，以多巴胺DA处理后提取 mMx，然后结合应用抑制消减杂交侣u以ession subtractlvehybridization，SSH）和选择性差异筛选（PCR·Select Differential Screening）方法，分离获得27个DA调节表达cDNA克隆。经Northern杂交验证，序列测定与生物信息学分析，明确了 14个 DA调节表达的基因，包括神经递质转运相关的多功能调节蛋白泛素蛋白连接酶Nedd4，调节细胞分泌活动的内质网钙联结蛋白，能量代谢相关的葡萄糖调节蛋白，DA代谢相关酶NAD（P）H－酮还原酶和NADH－泛酮氧化还原酶，以及铁蛋白H亚单位等。实验结果提示＊pA激活了胶质细胞内复杂的信号传递通路，并且涉及生长因子信号途径、凿体激素信号途径和白介素调节通路之间的相互交流（cros叶alking卜（）信号传递的靶基因有四类：代谢酶，应激蛋白，转运蛋白，以及生长发育调节蛋白等。O）其中几个基因变异与神经疾病密切相关，也提示多巴胺能神经疾病与非多巴胺能神经疾病之间也有某些共同的机制。 Vlll 人类基因的发现及功能研究，尤其重要疾病的相关基因研究是目前世界范围的重大课题。多巴胺＊opamine，DA）是中枢神经系统重要的神经递质，与神经系统重大医学问题联系最为紧密。胶质细胞DA相关基因的克隆对揭示胶质细胞在DA系统中的重要作用，以及对揭示帕金森病，精神分裂症和药物成噶等DA系统疾病的病因，提高临床诊断以及治疗水平有重要的应用价值。本研究采用同源克隆策略川 CIOllillg），采用DA处理的大鼠星形胶质细胞的消减PCR探针，筛选人类胎脑cDNA噬菌体文库。通过高质量全长cDNA噬菌体文库的构建，经过严格的杂交的筛选，挑选了96个阳性克隆，经过测序分析明确了61条DA相关的全长基因，并且筛选到数个全长的新基因。通过文献查阅与生物信息学分析，比较全面地了解了DA激活星形胶质细胞的信号传递机制及其相关功能意义，并且新基因的克隆为进一步的基因功能研究及其开发应用研究奠定了重要的基础。在我们筛选到的数条新的人类全长cDNA基因中，依据生物信息学分析我们选择两

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英文缩写词表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-14
第一部分大鼠胶质细胞多巴胺反应基因的抑制消减杂交的筛选  14-54
  材料与方法  15-37
  结果  37-38
  讨论  38-48
  参考文献  48-54
第二部分人类胶质细胞多巴胺反应基因的克隆及测序分析  54-86
  材料与方法  56-64
  结果  64-75
  讨论  75-79
  参考文献  79-86
第三部分两条新的星形胶质细胞多巴胺反应基因的初步研究  86-133
  材料与方法  87-106
  结果  106-124
  讨论  124-129
  参考文献  129-133
文献综述一胶质细胞-神经元之间的相互通讯联系  133-149
  参考文献  143-149
文献综述二后基因组研究与生物信息学  149-165
  参考文献  162-165
附录  165-169
博士期间发表的论文  169-170
致谢  170-172

胶质细胞多巴胺反应基因克隆及其特征分析

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