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梨火疫病菌的风险分析及检测技术研究

作　者: 胡白石
导　师: 许志刚
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 梨火疫病风险分析检测技木玻片凝集协同凝集琼脂双扩散免疫荧光膜上免疫分离品种感病性植物检疫
分类号: S432.4
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

本论文主要进行了梨火疫病菌的风险分析、国内部分蔷薇科植物对梨火疫病的感病性及梨火疫病菌的检测技术研究。一、梨火疫病菌的风险分析参照国际植物检疫措施标准，结合我国实际情况，分别构建了以传播途径和以有害生物为起点的有害生物风险分析（PRA）体系；对构建的风险体系进行了验证。利用构建的风险分析体系对梨火疫病菌进行了风险分析。构建的风险分析体系分为4个阶段：风险分析的起动、风险评估、风险管理和风险交流。以传播途径为起点的PRA注意到了进境物本身的风险。首次应用生物安全评估的通用公式R=f（S，P），对携带的有害生物进行风险评估。将通用公式简化为R=SXP，较客观地解决了有害生物风险（R）与各风险相关因子之间的运算关系。根据R值，将有害生物划分为低度风险、中度风险、高度风险和特高风险4个风险级别，建议对中度以上风险的有害生物采取检疫措施。以有害生物为起点的PAR，除起动阶段不同外，其余阶段与以传播途径为起点的PRA基本相同。利用已经发表的有害生物风险相关数据，对构建的风险分析体系进行了初步验证，证明了该风险分析体系的可行性。利用构建的风险分析体系，在收集资料和试验的基础上，对梨火疫病菌进入我国的风险进行了分析，运算得出R=10.108，属于特高风险有害生物。提出了相应的风险管理措施。二、国内部分蔷薇科植物的感病性及供试菌株致病力的初步研究利用从全国各地收集的蔷薇科9属、18种植物的幼苗、花序、一年生嫩枝、及幼果，利用梨火疫病菌的3个供试菌株，对幼苗、花器、嫩枝和幼果的感病性进行了研究。结果表明梨的感病性高于苹果；白梨、西洋梨和杜梨的感病性高于沙梨品种；其他蔷薇科植物感病性低于梨和苹果；花器和幼果的感病性高于枝条和幼苗；所有供试活体接种的梨品种均感梨火疫病；花序离体接种的所有供试梨和苹果属植物（品种）均感梨火疫病。梨幼果接种表明，幼果的感病性与花序和植株的感病性有相关性。评价梨品种感病性最佳的方法是幼苗的活体接种；花序接种、梨幼果碟片接种法结果与梨幼果半果法一致。碟片接种法便于统计和节省材料而优于半果接种法。接种结果显示：0056和Ea菌株的致病力相当，明显高于0036菌株。0056菌株活体接种表明，供试梨和苹果品种的感病性由高至低的次序为：杜梨、象牙白、酥梨、鸭梨、早酥、巴梨、茄梨、爱宕、金20世纪、新兴、丰水、和伏翠（苹果）。收集的国内部分蔷薇科植物感病性试验表明，国内广泛存在梨火疫病的寄主，尤其以梨最为感病。我国广泛种植的富士、嘎拉等主栽品种高感梨火疫病，其他蔷薇科植物也不同程度地感梨火疫病。由于很多蔷薇科植物是公园绿化的主要树种，因此梨火疫病对我国梨和苹果生产及环境美化有极大的潜在风险。三、梨火疫病菌的检测技术研究卜利用梨火疫病菌的Ea、0056和0036菌株不同处理的全菌体及提取的3个菌体组分作为免疫原：脂多糖（LPS人 2种胞外多糖（EPSI和 EPSZ＊常规免疫家兔，获得8种抗血清。利用玻片凝集反应、琼脂双扩散（ODD）和ELISA法测定了抗血清的效价和专化性；利用膜吸附法测定了各种抗血清的吸附目标菌的能力。结果表明：全菌体、胞外多糖和脂多糖作为免疫原，均可获得高效价的抗血清；不同的免疫原制备的抗血清专化性有差异。由 LPS、EP SI和 EPSZ制备的抗血清（ASL、ASSI和ASSZ）以及由戊H醛固定全菌体抗原制备的抗血清（AS EaEa、AS56和 AS36）专化性相当；其次是热固定全菌体制备的抗血清（ASEaR）；专化性最差的是活菌体制备的抗血清（ASEaH ）o 比较了3种血清学检测方法的灵敏度和专化性，灵敏度由高至低为：ELISA、玻片凝集反应和ODD；专化性由高至低为：ODD、ELISA和玻片凝集反应。膜吸附效率比较发现，AsL的吸附效率最高。由活菌体为免疫原制备的抗血清适宜于鉴定细菌间的血清学关系；所有方法制备的抗血清均适用于ODD；除活菌体为免疫原制备的抗血清外，其余抗血清均适用于玻片凝集反应和ELISA反应。由LPS制备的抗血清最适宜用于免疫分离。2．利用Tns转座子诱变梨火疫病菌0056菌株。以野生型菌的抗血清（As56），用玻片凝集法测定了！000个结合子，ODD法随机测定了50个结合子，均与野生型菌株的抗血清发生了明显的血清学反应，证明利用多抗血清检测梨火疫病菌，因细菌发生突变而漏检的几率很小。3．在国内首次利用LB、NSA和MMZCll培养基，结合血清学技术，对在隔离温室中人工接种发病的梨枝条进行了分离和鉴定。试验表明MMZCU培养基对梨火疫病菌的鉴定作用优于NSA培养基。该方法可直接分离并同时鉴定梨火疫病菌。4．首次利用梨火疫病菌的抗血清，单面包被混合纤维素滤膜，结合选择性培养基，建立了膜上免疫分离新技术，对梨火疫病菌接种样品进行了选择性分离，灵敏度达sxlo‘cfu／ml。利用该方法从稻种上选择分离白叶枯和条斑病菌获得了成功。5．利用 AS56、

全文目录

中文摘要  6-9
引言  9-11
上篇文献综述  11-58
  第一章梨火疫病的历史、危害及生物学  12-18
  第二章梨火疫病的风险分析  18-23
  第三章梨火疫病的控制和铲除  23-31
  第四章侵染梨和苹果的其他细菌病害  31-36
  第五章梨火疫病的检测技术  36-45
  参考文献  45-58
下篇研究内容  58-135
  第一章梨火疫病菌的风险分析  59-82
    1．1 风险分析程序  59-63
    1．2 风险分析体系的构建  63-71
    1．3 风险分析体系的初步验证  71-73
    1．4 梨火疫病菌的风险分析  73-82
  第二章国内部分蔷薇科植物和梨、苹果品种对梨火疫病的感病性及供试菌株致病力的初步研究  82-95
    2．1 材料和方法  82-85
    2．2 结果  85-92
    2．3 讨论  92-95
  第三章梨火疫病菌检测技术研究  95-135
    3．1 梨火疫病菌特异性抗血清的制备及应用评价研究  95-106
      3．1．1 材料和方法  95-98
      3．1．2 结果  98-103
      3．1．3 讨论  103-104
      3．1．4 结论  104-106
    3．2 转座子Tn5诱变梨火疫病菌及突变体与野生型菌的血清学关系  106-109
      3．2．1 材料和方法  106-107
      3．2．2 结果  107-108
      3．2．3 讨论  108-109
    3．3 分离培养结合血清学方法检测和鉴定梨火疫病菌的研究  109-113
      3．3．1 材料和方法  109-110
      3．3．2 结果  110-111
      3．3．3 讨论  111-113
    3．4 膜上免疫分离法的建立及在种传细菌检测中的应用  113-117
      3．4．1 膜上免疫分离法的建立  113-115
        3．4．1．1 材料和方法  113-114
        3．4．1．2 结果  114-115
      3．4．2 膜上免疫分离法在水稻种传细菌病害检测中的应用  115
        3．4．2．1 材料和方法  115
        3．4．2．2 结果  115
      3．4．3 讨论  115-117
    3．5 利用协同凝集反应检测梨火疫病菌的研究  117-123
      3．5．1 材料和方法  117-119
      3．5．2 结果  119-121
      3．5．3 讨论  121-122
      3．5．4 结论  122-123
    3．6 酶联免疫吸附分析法检测梨火疫病菌的研究  123-127
      3．6．1 材料和方法  123-124
      3．6．2 结果  124-125
      3．6．3 讨论  125-127
    3．7 间接免疫荧光染色技术检测梨火疫病菌的研究  127-135
      3．7．1 材料和方法  127
      3．7．2 结果  127-132
      3．7．3 讨论  132-135
英文摘要  135-138
附录论文应用的植物检疫术语  138-139
致谢  139-140
作者简介  140

梨火疫病菌的风险分析及检测技术研究

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