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梨火疫病原菌核糖体基因结构序列的特征研究及病菌的分子检测

作　者: 刘华威
导　师: 王晓鸣；郭庆元
学　校: 新疆农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 梨火疫病菌 分子检测 核糖体基因 序列分析 抗性鉴定
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 92次
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内容摘要


梨火疫病菌(Erwinia amylovory)引起的梨火疫病是梨树、苹果树等蔷薇科植物上是最具毁灭性的病害之一,是我国重要的进境检疫对象。梨火疫病菌的长距离传播主要靠不同地区间繁殖材料和水果的调运完成。因此,完善梨火疫病菌的检测体系有助于控制梨火疫病在我国的传播。本研究利用细菌通用引物16SF/16SR扩增出梨火疫病菌16S的1489bp核糖体基因片段,根据16S序列比对,与GenBank中登记序号为AF141895.1的梨火疫病菌16S序列有98%的相似性,即证明菌株的正确性。利用细菌通用引物C1/C3扩增23S序列,其长度为2446bp。在23S、16S片段中设计引物23SL/16SL,ITS-S/ITS-R分别扩增16S与23S间和ITS1序列,扩增片段大小分别为1657bp、397 bp,经软件编辑,梨火疫病菌核糖体基因全长为5813 bp,其中ITS1为397bp,23S为2917bp,ITS2序列为88bp,5S为115bp,IGS为807bp,其中ITS1序列中含有一个tRNA-Glu。利用DNAMan、DNAsist1.0、Primer 5.0软件,对23S、IGS碱基序列的酶切位点、ORF、motif结构进行初步分析。利用软件包EXPAsY将23S、IGS碱基序列推导为氨基酸序列后,对等电点、跨膜螺旋、疏水性等进行计算、预测;预测这些氨基酸序列二级结构,结果显示梨火疫病菌的23S、IGS氨基酸二级结构均有α螺旋,β折叠;据PDB数据库的氨基酸二级结构比对结果表明,23S与编号为2EZU65的氨基酸相似性为33%,IGS与编号为2GMW66的氨基酸相似性为75%。据23S、IGS序列设计的特异引物23SF/23SR、IGS-S/IGS-R,分别在梨火疫病菌中扩增出166bp和154bp特异片段,检测的灵敏度分别为10-6μg/mL和10-7μg /mL,量化为细菌个数,23SF/23SR检测灵敏度为3.4x102cfu/ml。根据梨火疫病在中国的潜在预测分布,采集可能分布区内幼梨品种接种,结果表明所采集的46份中国梨品质中9份感病,37份抗病;8份外国梨品质中,6份感病。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 文献综述  8-25
  1 研究背景  8-14
    1.1 病害简介  8
    1.2 病原菌形态及生物学特征  8-9
    1.3 危害症状  9-10
    1.4 细菌分类的概况及梨火疫病菌与韩国、日本株系的关系  10
    1.5 寄主范围  10-11
    1.6 检疫的重要性  11-12
    1.7 传播及地理分布  12-13
    1.8 预测预报  13-14
  2 植物病原细菌研究中的技术与应用  14-19
    2.1 常规检测技术  14-15
    2.2 血清学技术  15-16
    2.3 脂肪酸图谱技术  16
    2.4 MicroStation TM 自动化细菌鉴定系统  16-17
    2.5 分子检测技术  17-19
  3 梨火疫病菌的检测研究进展  19-22
    3.1 常规检测方法  19-20
    3.2 免疫学检测方法  20-21
    3.3 核酸探针技术及多聚酶链式反应（PCR）技术  21-22
  4 核糖体基因的研究概况  22-23
    4.1 关于 23SrDNA 序列的研究  23
    4.2 关于IGS 序列的研究  23
  5 研究的目的与意义  23-25
第二章 梨火疫病原菌操纵子的扩增及 23SrDNA和IGS序列的分析  25-53
  1 材料和方法  25-30
    1.1 实验材料  25
    1.2 研究方法  25-30
  2 结果分析  30-53
    2.1 菌株的培养  30-31
    2.2 细菌基因组DNA 的提取  31
    2.3 16S、23S 片段扩增  31-32
    2.4 片段的克隆测序  32
    2.5 核糖体基因序列的扩增结果及分析  32-35
    2.6 23SrDNA、IGS 序列比对、分析  35-53
第三章 基于23SrDNA和IGS序列的梨火疫病原菌分子检测方法  53-57
  1 材料与方法  53-54
    1.1 材料  53
    1.2 方法  53-54
  2 结果与分析  54-57
    2.1 引物的特异性检测  54
    2.2 引物的灵敏性检测  54-55
    2.3 梨火疫病菌分子检测技术的构建  55
    2.4 梨火疫病菌的模拟检测  55-57
第四章 部分梨品种对梨火疫病原菌的抗性研究  57-61
  1 材料与方法  57-58
    1.1 材料  57-58
    1.2 方法  58
  2 结果与分析  58-61
    2.1 梨种质的抗性反应表型  58-59
    2.2 分子检测对抗感类型的再确定  59
    2.3 不同梨种质的抗性特征  59-61
第五章 结论及讨论  61-65
  5.1 结论  61
  5.2 讨论  61-65
参考文献  65-70
致谢  70-71
作者简介  71-72
附录  72-87

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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