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高迁移率族蛋白1在原发性肝细胞癌发展中的潜在作用

作　者: 贺新春
导　师: 范学工
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 高迁移率族蛋白-1 原发性肝细胞癌 细胞增殖 增殖细胞核抗原(PCNA) 细胞周期蛋白D1(cyclin D1) siRNA 瞬时转染
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景：原发性肝癌是一种病死率很高的临床危重症,在我国原发性肝癌最常见的病因是病毒性肝炎,其中主要的是乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染。而高迁移率族蛋白1 (high mobility group box chromosal protein 1, HMGB1)在细胞外作为一种关键的“晚期”炎症因子,已经成为癌症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在某些癌症发生发展中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨HMGB1在原发性肝癌发生发展中的潜在作用。目的：(1)研究肝癌患者肝组织、血清及外周血单个核细胞(PBMC)中HMGB1的表达水平。(2)体外观察HMGB1刺激是否能促进人肝细胞株HepG2细胞增殖并初步探讨其可能的机制。(3)探讨小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制HMGB1基因对人肝细胞株HepG2细胞生物学功能的影响。方法：(1)分别收集健康对照者血清及外周血单个核细胞(PBMC),肝癌患者血清、PBMC、肝癌组织及癌旁组织,利用RT-PCR、Western blot和免疫组化技术,分别从mRNA水平和蛋白质水平研究肝癌患者组织、血清及PBMC中HMGB1表达的情况。同时行HE染色,评估肝组织的病理学改变。(2)体外用不同浓度重组HMGB1 (rHMGB1)刺激人肝细胞株HepG2细胞,不同时间点分别收集细胞。台盼蓝拒染法和噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡率,以明确细胞是否凋亡或坏死。RT-PCR和Westernblot检测细胞中PCNA、cyclin D1表达的变化。(3)设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNAH2、siRNAH3),同时设未转染组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组)。脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过RT-PCR和Western blot检测HMGB1基因在mRNA水平及蛋白质水平的变化以验证HMGB1 siRNA抑制效果；MTT法检测细胞存活率并绘制生长曲线；RT-PCR和Western blot检测PCNA、cyclin D1表达的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率,以明确抑制HMGB1表达后能否诱导细胞凋亡,同时测定培养上清中AFP的含量。结果：(1)肝癌患者癌组织中HMGB1无论是mRNA水平(2.02±0.25)还是蛋白水平(0.78±0.13)均明显高于相对应的癌旁组织的mRNA水平(1.08±0.12)和蛋白水平(0.325±0.11)(P<0.01)。同样,免疫组化结果显示癌组织中HMGB1表达明显高于相对应的癌旁组织。而血清中HMGB1蛋白相对浓度及PBMC中HMGB1 mRNA的含量与健康对照组之间无差别(P>0.05)。(2)MTT结果显示不同剂量(10、50、100ng/ml) rHMGB1组HepG2细胞增殖能力均明显高于HepG2细胞空白对照组(P<0.05)。HMGB1抗体(20μg/ml)能阻断HMGB1 (10ng/ml)对HepG2细胞的增殖作用。Western blot和RT-PCR显示,HMGB1能明显上调HepG2细胞中PCNA、cyclin D1蛋白和mRNA的表达(P<0.05), HMGB1抗体能明显抑制HMGB1上调PCNA、cyclinD1蛋白和mRNA表达的作用(P<0.05)。台盼蓝拒染法和TUNEL检测排除了细胞处于凋亡或坏死状态。(3)3对特异性HMGB1-siRNAs转染HepG2细胞后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024,1.014±0.042,0.415±0.055,较单纯脂质体对照组(Lipo组)的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均<0.01)；3对特异性HMGB1-siRNAs转染HepG2细胞后,HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035,0.340±0.028,0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),以siRNAH3抑制作用最强,抑制率可达到70-80%。转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力在72h、96h、120h时受到明显抑制,与Lipo组相比,其F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均<0.01,HepG2细胞中PCNA及cyclin D1 mRNA和蛋白表达下降,AFP含量也下降(P<0.01),而细胞凋亡指数明显增高(P<0.01)。结论：(1)证实HMGB1在肝癌癌组织中是明显升高的,其表达与肝癌的发生、发展密切相关。(2) HMGB1明显促进HepG2细胞增殖,HMGB1抗体能拮抗外源性HMGB1的增殖作用。(3)靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝细胞HepG2的生长,诱导HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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