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BMP4在阿霉素诱导肺癌细胞过早性衰老的作用及机制研究

作　者: 苏冬梅
导　师: 黄百渠
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 阿霉素 BMP4 过早性衰老肺癌
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

细胞衰老是细胞进入一种周期不可逆转的停滞而达到的相对稳定状态。细胞衰老包括复制性衰老和过早性衰老两种形式,其中过早性衰老这种方式可以更为快速并有效地抑制肿瘤细胞的增殖。化疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。化疗药物阿霉素在肿瘤的临床治疗上得到了广泛的应用,然而它抑制肿瘤的机制还不是完全清楚。我们实验结果显示化疗药物阿霉素抑制肺癌是通过促进肺癌细胞衰老来实现的,同时发现在阿霉素诱导肺癌细胞衰老过程中BMP4的表达水平显著升高。RNAi干涉实验表明,下调BMP4的表达可以明显抵制化疗药物阿霉素对衰老的诱导作用,说明BMP4很有可能是化疗药物阿霉素激活的下游靶基因,并在阿霉素对衰老的诱导过程中起着重要的调节作用。为了进一步深入研究BMP4参与阿霉素诱导肺癌细胞衰老的分子机制,我们构建了四环素调节BMP4表达的稳定转染细胞系。实验结果表明,作为上游信号分子的BMP4通过激活下游的Smad和p38信号通路来实现对衰老的调节作用。并且研究还显示,BMP4可以通过提高抑癌基因p16^INK4a和p21^WAF1/cip1的表达促进肺癌细胞衰老。Western blotting和染色质免疫沉淀实验结果表明,p16^INK4a和p21^WAF1/cip1表达水平的上升是通过BMP4提高转录因子Smad磷酸化水平,增强这些转录因子对下游靶基因p16^INK4a和p21^WAF1/cip1启动子的结合,并进而招募乙酰转移酶p300到p16^INK4a和p21^WAF1/cip1启动子上,促进它们启动子上组蛋白H3和H4乙酰化水平增加来实现的。总之,我们的实验表明,化疗药物阿霉素能够通过促进肺癌细胞的过早性衰老而抑制肿瘤的生长,而且BMP4在阿霉素诱导衰老过程中起着重要的调节作用。我们的研究为BMP4作为化疗药物新的靶点提供了重要的线索和实验证据。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-9
引言  9-29
  一、BMPs 家族简介  9-14
    （一） BMPs 及其受体  9-11
    （二） BMP 激活的信号通路  11-13
    （三） BMP4 基因及其功能研究  13-14
  二、细胞衰老与肿瘤关系  14-21
    （一）细胞衰老的介绍  14-15
    （二）复制性衰老与过早性衰老  15-16
    （三）衰老与肿瘤的相关性  16-21
  三、组蛋白乙酰化修饰与物基因的转录调控  21-26
    （一）真核生物的染色质结构与基因的转录调控  21-22
    （二）组蛋白乙酰化修饰与转录调控  22-23
    （三）组蛋白乙酰转移酶的分类与功能  23-26
  四、本论文研究的内容和意义  26-29
    （一）立题依据  26-27
    （二）本论文的研究内容和意义  27-29
实验材料与方法  29-44
  一、实验材料  29-30
    （一）质粒  29
    （二）抗体与蛋白质  29
    （三）哺乳动物细胞系  29
    （四）实验试剂  29-30
  二、实验方法  30-44
    Ⅰ. 分子生物学实验方法  30-37
      （一）分子克隆  30
      （二）质粒大量制备的方法  30-32
      （三）琼脂糖电泳  32
      （四）哺乳动物细胞总RNA 的提取和反转录  32-33
      （五） PCR 和荧光实时定量（Real-time）PCR  33-35
      （六）染色质免疫沉淀实验（Chromatin immounoprecipitation，ChIP）  35-36
      （七） RNA 干涉（RNAi）  36-37
    Ⅱ. 细胞生物学实验方法  37-43
      （一）哺乳动物细胞系的培养  37
      （二）真核生物细胞系的脂质体和罗氏瞬时转染  37
      （三）真核生物细胞的磷酸钙转染和荧光素酶报告基因检测  37-39
      （四）建立稳定转染细胞系  39
      （五）蛋白质的Western Blot 分析  39-41
      （六）免疫荧光（Cellular Immonunofluorescence）实验  41-42
      （七） MTT 细胞活性检测实验  42
      （八）衰老染色实验  42-43
    Ⅲ. 统计分析  43-44
实验结果与分析  44-66
  一、BMP4 参与调节化疗药物阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老  44-48
    （一）化疗药物阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老  44-45
    （二） BMP4 参与调节阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老  45-48
  二、BMP4 参与调节阿霉素诱导衰老的的分子机制及意义  48-57
    （一） BMP4 过表达诱导肺癌细胞走向过早性衰老  48-49
    （二） BMP4诱导肺癌细胞走向过早性衰老重要通过上调周期相关蛋p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）表达实现的  49-50
    （三）由BMP4 所激活的Smad 信号途径在BMP4 调节肺癌细胞衰老中其重要作用  50-53
    （四） p38MAPK 信号途径参与调节BMP4 诱导的肺癌细胞衰老  53-57
  三、组蛋白乙酰化参与调节BMP4 对周期相关基因的表达调控  57-63
    （一） BMP4 通过促进p16~（INK4a）和p21WAF1基因转录来上调 p16INK4a 和p21~（WAF1/cip1）蛋白水平  57-60
    （二）乙酰转移酶p300 参与BMP4 促进启动子上组蛋白H3、H4 乙酰化水平增加  60-61
    （三） Smad 蛋白招募乙酰转移酶p300 到p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）启动子上促进组蛋白H3，H4 乙酰化水平增加  61-63
  四、p53 和BMP4 途径共同参与阿霉素对衰老的促进作用  63-66
    （一） p53 在阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老中起重要调节作用  63-65
    （二）共同干涉p53 和BMP4 明显抵制阿霉素对衰老的促进作用  65-66
讨论  66-70
  一、BMP4 与化疗药物阿霉素抑制肿瘤的关系  66-67
  二、BMP4 与 p53 途径共同参与调节阿霉素对衰老的促进作用  67
  三、Smad 信号途径的效应因子 Smad 蛋白促进 BMP4 下游靶基因 p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip11）转录激活的具体机制  67-68
  四、由BMP4 所激活的Smad 和p38MAPK 信号途径在调节BMP4 促进肺癌细胞衰老中相关性  68
  五、组蛋白乙酰化在BMP4 促进衰老相关基因p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）表达中的调节作用  68-70
主要结论和创新点  70-71
  一、主要结论  70
  二、主要创新点  70-71
参考文献  71-83
附录  83-85
致谢  85-86
在学期间公开发表论文及著作情况  86

BMP4在阿霉素诱导肺癌细胞过早性衰老的作用及机制研究

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