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革皮氏海参总皂苷促进小鼠骨髓造血机能的作用及其机制的研究

作　者: 李冰
导　师: 王静凤
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 海参总皂苷 急性毒性 30天喂养 外周血象 造血干/祖细胞 促红细胞生成素 血小板生成素
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


海参皂苷是海参的主要次生代谢产物,是海参体内特有的一类三萜类化合物。本实验通过急性毒性、30d喂养实验研究革皮氏海参总皂苷对小鼠或大鼠的一般毒性以及长期摄入对生长发育产生的有害效应,并检测其毒作用性质和靶器官,观察长期摄入对机体造成的危害。在确定海参皂苷的毒作用性质及半数致死量(median lethal dose,LD50)的基础上,在其安全性应用范围内来研究海参皂苷对小鼠骨髓造血机能的促进作用。本实验采用连续3次腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide,Cy)的方法建立骨髓抑制小鼠模型。采用0.5%羧甲基纤维素调制的革皮氏海参总皂苷灌胃模型小鼠,研究其对小鼠骨髓造血功能的影响,并对其作用机理进行了较系统和深入地研究。主要研究结果如下:革皮氏海参总皂苷对小鼠的LD50:雄性为1.08g/kg,雌性为1.1 g/kg。一次性灌胃海参皂苷,小鼠血清中尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、谷草转氨酶(aspartate aminotarnferase , AST)和谷丙转氨酶(alaninetransaminase,ALT)含量同正常对照组无显著差异,说明海参皂苷对小鼠肾脏和肝脏功能无明显损伤效应。30d喂养实验显示,海参皂苷对大鼠血液生化学和尿液生化学指标均无显著影响,说明其对大鼠肝脏,肾脏和心血管等器官无明显毒性损伤。另外,海参皂苷明显促进雄性大鼠外周血中白细胞(white blood cell,WBC)数和血小板数(plastocyte,PLT)增加。采用细胞培养和组织培养方法,研究海参皂苷对骨髓造血功能的影响。结果表明,海参总皂苷促进小鼠WBC、RBC、PLT和血红蛋白(hemoglobin,Hb)含量以及网织红细胞(reticulocyte,RET)数量,促进骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cell,BMNC)分裂增殖,刺激造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSC)的增殖与分化,对体外培养粒-单系(P<0.01)、红系(P<0.05)和巨核系祖细胞(P<0.01)集落生成有明显的促进作用;同时海参皂苷刺激肺、脾脏和腹腔巨噬细胞等组织中分泌多种造血生长因子,促进小鼠骨髓造血。利用流式细胞术、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法检测海参总皂苷对小鼠骨髓细胞细胞周期分布和细胞凋亡的影响。结果显示,海参皂苷促进骨髓细胞从S期进入到G2/M期,同时促进细胞G2/M期调控点cyclin B1基因的表达,促进细胞有丝分裂;提高抑制凋亡基因bcl-2和bcl-xl mRNA的表达(P<0.01,P<0.01),抑制细胞凋亡。说明海参皂苷可通过调整细胞周期、促进细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡,来促进小鼠骨髓造血功能。通过RT-PCR法检测小鼠骨髓细胞造血生长因子粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyre-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EPOR)和血小板生成素(thrombopoietin,TPO) mRNA表达。结果显示,海参皂苷显著促进骨髓细胞EPOR(P<0.05)、GM-CSF(P<0.01)和TPO mRNA(P<0.01)的表达,推测海参皂苷通过促进小鼠骨髓细胞合成和分泌EPO、GM-CSF或TPO,有效促进EPO、GM-CSF或TPO与其相应受体结合,刺激骨髓红系祖细胞、粒-单系祖细胞或巨核系祖细胞的增殖和分化,达到促进造血的功能。本论文首次对海参皂苷的安全性评价进行分析,为其以后在临床上的应用以及营养品和保健品等领域提供一定的科学依据。在其安全性应用范围内研究海参皂苷促进小鼠骨髓造血功能的作用,并对其机制进行探讨,为海参皂苷的的开发和高值化利用提供一定的理论基础。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-16
前言  16-24
  1 骨髓造血调控  16-21
    1.1 造血细胞发生  16-17
      1.1.1 造血干细胞  16
      1.1.2 造血祖细胞  16-17
        1.1.2.1 粒-单核系祖细胞  16-17
        1.1.2.2 红系祖细胞  17
        1.1.2.3 巨核系祖细胞  17
    1.2 细胞因子及其受体的相互作用  17-19
      1.2.1 细胞因子对骨髓粒-单系祖细胞调控的影响  17-18
      1.2.2 细胞因子对骨髓红系祖细胞调控的影响  18
      1.2.3 细胞因子对骨髓巨核系祖细胞调控的影响  18-19
    1.3 骨髓细胞细胞周期与细胞凋亡  19-21
      1.3.1 概述  19
      1.3.2 骨髓细胞周期  19-20
      1.3.3 骨髓细胞凋亡  20-21
  2 海参皂苷的研究进展  21-22
    皂苷类物质促进造血功能的研究进展  22
  3 立题依据及研究的目的和意义  22-24
第一章 革皮氏海参总皂苷的安全性评价  24-37
  第一节 革皮氏海参总皂苷的急性毒性实验  24-29
    1 材料和方法  24-26
      1.1 材料  24-25
        1.1.1 革皮氏海参  24
        1.1.2 实验动物  24-25
        1.1.3 试剂和仪器  25
          1.1.3.1 实验试剂  25
          1.1.3.2 实验仪器  25
      1.2 实验方法  25-26
        1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  25
        1.2.2 预实验  25
        1.2.3 正式实验  25-26
          1.2.3.1 动物分组  25-26
          1.2.3.2 对小鼠外周血象的影响  26
          1.2.3.3 对小鼠血液生化指标的影响  26
      1.3 统计学分析  26
    2 结果和讨论  26-28
      2.1 小鼠的一般形态观察  26
      2.2 半数致死量的确定  26-27
      2.3 对小鼠外周血象的影响  27
      2.4 对小鼠血液生化指标的影响  27-28
        2.4.1 对血清BUN 和Cr 含量的影响  27-28
        2.4.2 对小鼠血清AST 和ALT 含量的影响  28
    3 结论  28-29
  第二节 海参皂苷对大鼠30 天喂养实验的影响  29-37
    1 材料和方法  29-31
      1.1 材料  29
        1.1.1 革皮氏海参  29
        1.1.2 实验动物  29
        1.1.3 试剂和仪器  29
      1.2 实验方法  29-31
        1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  29
        1.2.2 动物分组及实验  29-30
        1.2.3 血清中葡萄糖含量的测定  30
        1.2.4 血清中白蛋白和总蛋白含量的测定  30
        1.2.5 血清中乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量的测定  30
        1.2.6 血清BUN 含量的测定  30
        1.2.7 血清Cr 含量的测定  30
        1.2.8 血清尿酸含量的测定  30
        1.2.9 血清中低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、总脂质和甘油三酯含量的测定  30
        1.2.10 血清中AST 和ALT 含量的测定  30
        1.2.11 对大鼠尿液中尿酸、BUN 和Cr 含量的影响  30-31
      1.3 统计学分析  31
    2 结果和讨论  31-36
      2.1 一般状况观察  31-32
        2.1.1 海参皂苷对大鼠体重的影响  31
        2.1.2 海参皂苷对大鼠食量的影响  31-32
      2.2 海参皂苷对大鼠外周血象的影响  32
      2.3 对血液生化学指标的影响  32-35
        2.3.1 对大鼠血糖(blood sugar)含量的影响  32-33
        2.3.2 对大鼠血清中白蛋白和总蛋白含量的影响  33
        2.3.3 对大鼠血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量的影响  33-34
        2.3.4 对大鼠血清尿素氮、肌酐和尿酸含量的影响  34
        2.3.5 对大鼠血清中脂质含量的影响  34-35
        2.3.6 对大鼠血清中AST 和ALT 含量的测定  35
      2.4 对大鼠尿液中UA、BUN 和Cr 含量的影响  35-36
    3 小结  36-37
第二章 革皮氏海参总皂苷促进小鼠造血功能的影响  37-58
  第一节 海参皂苷对小鼠骨髓细胞增殖和分化的影响  37-47
    1 材料与方法  37-40
      1.1 材料  37-38
        1.1.1 革皮氏海参  37
        1.1.2 实验动物  37
        1.1.3 试剂与仪器  37-38
          1.1.3.1 实验试剂  37-38
          1.1.3.2 实验仪器  38
      1.2 实验方法  38-40
        1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  38
        1.2.2 动物分组及模型建立  38
        1.2.3 对小鼠RET 的测定  38-39
        1.2.4 对小鼠骨髓有核细胞数的测定  39
        1.2.5 对小鼠造血干细胞的测定  39
        1.2.6 对小鼠造血祖细胞集落形成的测定  39-40
          1.2.6.1 粒-单系祖细胞集落培养  39-40
          1.2.6.2 红系祖细胞集落培养  40
          1.2.6.3 巨核系祖细胞集落培养  40
      1.3 统计学分析  40
    2 结果  40-44
      2.1 对小鼠外周血象动态变化的影响  40-41
      2.2 对小鼠网织红细胞数的影响  41-42
      2.3 对小鼠骨髓有核细胞数的影响  42
      2.4 对小鼠造血干细胞增殖和分化的影响  42-43
      2.5 对小鼠造血祖细胞的影响  43-44
        2.5.1 对小鼠粒-单系祖细胞集落形成的影响  43-44
        2.5.2 对小鼠红系祖细胞集落形成的影响  44
        2.5.3 对小鼠巨核系祖细胞集落形成的影响  44
    3 讨论  44-46
    4 小结  46-47
  第二节 海参皂苷对小鼠分泌集落刺激因子的影响  47-58
    1 材料与方法  47-49
      1.1 材料  47
        1.1.1 革皮氏海参  47
        1.1.2 实验动物  47
        1.1.3 试剂与仪器  47
          1.1.3.1 实验试剂  47
          1.1.3.2 实验仪器  47
      1.2 实验方法  47-49
        1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  47
        1.2.2 动物分组及模型建立  47-48
        1.2.3 鼠肺条件培养液(lung cell conditioned medium，LCM)的制备  48
        1.2.4 脾条件培养液(spleen cell conditioned medium，SCM)的制备  48
        1.2.5 腹腔巨噬细胞条件培养液(peritoneal cavity macrophage conditioned medium，PMΦCM)的制备  48
        1.2.6 集落刺激因子(colony stimulating factors，CSFs)活性测定  48-49
        1.2.7 对小鼠造血祖细胞集落形成的测定  49
          1.2.7.1 粒-单系祖细胞集落培养  49
          1.2.7.2 红系祖细胞集落培养  49
          1.2.7.3 巨核系祖细胞集落培养  49
      1.3 统计学分析  49
    2 结果  49-56
      2.1 对模型小鼠分泌CSFs 的影响  49-52
        2.1.1 鼠肺条件培养液对小鼠骨髓粒-单系祖细胞增殖和分化的影响  49-50
        2.1.2 SCM 对小鼠骨髓红系祖细胞增殖和分化的影响  50-51
        2.1.3 PMΦCM 对小鼠骨髓细胞增殖和分化的影响  51-52
      2.2 对小鼠造血祖细胞增殖和分化的影响  52-56
        2.2.1 对小鼠粒-单系祖细胞集落形成的影响  52-53
        2.2.2 对小鼠红系祖细胞集落形成的影响  53-54
        2.2.3 对小鼠巨核系祖细胞集落形成的影响  54-56
    3 讨论  56
    4 小结  56-58
第三章 革皮氏海参总皂苷对小鼠骨髓造血细胞凋亡和细胞周期的影响  58-68
  1 材料与方法  58-61
    1.1 材料  58-59
      1.1.1 革皮氏海参  58
      1.1.2 实验动物  58
      1.1.3 试剂与仪器  58-59
        1.1.3.1 实验试剂  58-59
        1.1.3.2 实验仪器  59
    1.2 实验方法  59-61
      1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  59
      1.2.2 动物分组及模型建立  59
      1.2.3 对小鼠骨髓细胞细胞周期分布的影响  59-60
      1.2.4 对小鼠骨髓细胞凋亡的影响(Annexin V-FITC/PI 双染法)  60
      1.2.5 RT–PCR 法检测小鼠骨髓细胞细胞周期和细胞凋亡相关基因mRNA 表达  60-61
    1.3 统计学分析  61
  2 结果  61-65
    2.1 对小鼠骨髓细胞细胞周期分布的影响  61-62
    2.2 对小鼠骨髓细胞凋亡的影响  62-64
    2.3 对小鼠骨髓细胞周期基因 cyclin B1mRNA 表达的影响  64-65
    2.4 对细胞凋亡相关基因bcl-2 和bcl-xl mRNA 表达的影响  65
  3 讨论  65-67
  4 小结  67-68
第四章 革皮氏海参总皂苷对小鼠造血细胞因子基因m RNA 表达的影响  68-75
  1 材料与方法  68-70
    1.1 材料  68-69
      1.1.1 革皮氏海参  68
      1.1.2 实验动物  68
      1.1.3 试剂与仪器  68-69
    1.2 实验方法  69
      1.2.1 革皮氏海参总皂苷的制备  69
      1.2.2 动物分组及模型建立  69
      1.2.3 RT–PCR 法检测小鼠骨髓细胞中细胞因子GM-CSF、EPOR 和 TPO mRNA 表达  69
    1.3 统计学分析  69-70
  2 结果  70-72
    2.1 对小鼠骨髓造血细胞因子GM-CSF mRNA 表达的影响  70
    2.2 对小鼠骨髓造血细胞因子EPOR mRNA 表达的影响  70-71
    2.3 对小鼠骨髓造血细胞因子TPO mRNA 表达的影响  71-72
  3 讨论  72-74
  4 小结  74-75
结论  75-77
本论文的特色及创新之处  77-78
参考文献  78-87
致谢  87-88
个人简历  88-89
硕士在读期间发表论文情况  89

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