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src抑制的蛋白激酶C底物在炎症因子所致肺微血管内皮细胞通透性变化中的作用

作　者: 尤青海
导　师: 孙耕耘
学　校: 安徽医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肺微血管内皮细胞通透性炎症因子蛋白激酶C src抑制的蛋白激酶C底物小分子干扰RNA
分类号: R563
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景肺部炎症反应过程中,构成微循环交换血管最内层的肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)是炎症因子首先攻击的效应细胞,其病理生理改变之一是细胞通透性增加,严重时可导致肺水肿,这是急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)的主要发病环节之一。多种信号转导通路参与PMVECs通透性调控,其中蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信号转导通路被广泛研究。已知活化的PKC磷酸化底物蛋白、促进PMVECs骨架重构以及细胞间黏附连接物解聚,从而增加PMVECs通透性,但细胞内PKC下游信号转导错综复杂,所以PKC底物及其在PMVECs通透性调控中的作用机制值得深入研究。此外,在人体研究PMVECs通透性变化十分困难,目前关于PMVECs通透性的研究结果主要来自体外细胞实验,所以PMVECs单层的融合状态决定实验结果精确性。src抑制的蛋白激酶C底物(src-suppressed C kinase substrate, SSeCKS)是一新发现的PKC底物,可被活化的PKC磷酸化。多种细胞株研究发现SSeCKS蛋白参与肌动蛋白骨架和血脑屏障的动态调控,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导大鼠PMVECs高表达SSeCKS蛋白,这些研究提示SSeCKS可能是PMVECs通透性调控的重要效应分子,但其在炎症因子如白介素(interleukin, IL)-1β和肿瘤坏死因子(tumor necrosin factor, TNF)-α诱导PMVECs通透性增加中的具体作用仍未阐明。除LPS外,其他在肺部炎症反应过程中发挥重要作用的炎症介质是否参与PMVECs中SSeCKS的诱导表达也未见报道。IL-17F是一种新的炎症因子,大量研究表明在支气管上皮细胞和静脉内皮细胞中,IL-17F通过诱导IL-6、IL-8和细胞间黏附分子-1表达触发一系列炎症反应;肺炎克雷伯杆菌、支原体或白色念珠菌感染后,肺部增加的IL-17F诱发中性粒细胞聚集和变态反应,这些研究提示IL-17F是参与肺部炎症反应的重要细胞因子。目前关于肺部IL-17F作用机制的研究主要集中在支气管上皮细胞,并且对其细胞内信号转导通路知之甚少,PMVECs是肺部炎症反应时的主要效应细胞,但关于IL-17F对PMVECs的刺激效应以及细胞内信号转导通路的研究却未见报道。目的观察PMVECs单层融合前后的生物学特征。融合PMVECs单层用于实验,观察IL-17F对PMVECs通透性的影响以及SSeCKS信号通路在IL-1β、TNF-α和IL-17F诱导PMVECs通透性变化中的作用,为认识ALI/ARDS发生机制提供实验依据。方法体外培养大鼠PMVECs;在Transwell和硝酸醋酸混合纤维膜上构建PMVECs单层;倒置显微镜、苏木素-伊红染色、跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance, TER)、异硫氰酸荧光素标记葡聚糖法(Pd)以及Hank’s平衡液法(LP)观察细胞单层生物学特征;逆转录聚合酶链反应分析SSeCKS的mRNA变化;免疫印迹技术分析PKC活性以及SSeCKS蛋白变化;应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽观察PMVECs肌动蛋白骨架改变;此外,PMVECs还被特异性的SSeCKS小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染。结果1)1×105/cm2的PMVECs接种Transwell后,TER随接种时间延长稳定升高,接种后第四天达最高,尔后维持,第十天TER开始下降,而倒置显微镜观察到细胞接种后第三天已融合成单层;2×105/cm2的PMVECs接种Transwell后,TER达高峰时间提前到接种后第二天,第九天TER开始下降;不同密度接种组的TER最高值间比较无显著性差异(P > 0.05)。静息状态下融合PMVECs单层TER为48.07±2.84 ?·cm2、Pd为6.19±0.43×10-6 cm/s、LP为6.80±0.62×10-7 cm/s/cm H2O。2)10mg/L LPS分别刺激融合PMVECs单层0.5h和2h后,与未处理对照组比较,TER显著下降、LP和Pd均显著增加。3)5ng/ml IL-1β和10ng/ml TNF-α分别激活PMVECs的PKC信号通路和诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达,IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS表达的效应更显著;BIM (1μmol/L,PKC抑制剂)显著下调PMVECs的PKC活性和抑制IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达,而蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)抑制剂(H89,10μmol/L)和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)抑制剂(金雀异黄素,50μg/ml)不影响IL-1β+TNF-α诱导SSeCKS的mRNA和蛋白高表达。4)与未处理组比较,50nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVECs 12h后,SSeCKS mRNA表达显著下降、24h达最低值、持续到转染后96h,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS蛋白表达的最佳时间在转染48h后,抑制率接近50%,抑制效应持续到转染后120h;SSeCKS-siRNA转染还以浓度依赖方式(10、20、50 nmol/L)沉默SSeCKS mRNA和蛋白表达。无论是脂质体空转染、普通阴性对照siRNA转染还是SSeCKS-siRNA转染均使融合PMVECs的静息状态TER轻微下降、静息状态Pd略升高,但与未处理组比较无显著性差异(P > 0.05)。5 ) IL-1β+TNF-α刺激显著下调PMVECs的TER和增加PMVECs的Pd ,SSeCKS-siRNA转染可显著下调IL-1β+TNF-α诱导细胞单层通透性的增加,但改善效果与BIM的改善效果比较存在差异(P < 0.05)。6)不同浓度IL-17F(0.1、1、10、100ng/ml)刺激PMVECs 3h后,下降的TER和增加的Pd与未处理组比较差异显著;100ng/ml IL-17F刺激细胞0.5h后,Pd与未处理组比较增加了15%、3~6h后Pd达高峰、显著增加的Pd持续到刺激后24h;同Pd变化,IL-17F刺激PMVECs单层时,TER呈时间依赖性下降;1、10μmol/L BIM均能改善IL-17F诱导增加的Pd和下降的TER,但都未能使其恢复到正常值。7)IL-17F刺激3h后,PMVECs的丝状肌动蛋白重组:从细胞周边向细胞中心转移并成平行束状堆积、增厚,同时细胞旁缝隙显著增大;流式细胞技术检测发现IL-17F刺激后,PMVECs中丝状肌动蛋白的相对荧光强度曲线向右位移、其平均荧光强度与未处理组比较显著增加,而1、10μmol/L BIM均能有效改善IL-17F诱导PMVECs肌动蛋白骨架的重构。8)不同浓度(0.1、1、10、100ng/ml)IL-17F刺激PMVECs后,SSeCKS的mRNA和蛋白表达均显著增加;100ng/ml IL-17F刺激PMVECs时,SSeCKS基因表达在刺激后3h达高峰,而蛋白表达在刺激后6h达高峰;IL-17F刺激PMVECs 5min后,SSeCKS蛋白的丝氨酸被磷酸化、30min后显著、3~6h后达高峰、后维持在较高的磷酸化水平至刺激后24h,而1μmol/L BIM预孵育后,IL-17F诱导增加的蛋白磷酸化水平显著下降;此外,IL-17F刺激PMVECs 30min后,不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白显著增加,3~6h后,不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白达高峰;最后,静息状态时,SSeCKS蛋白大部分集中在细胞质,IL-17F刺激30min后,细胞膜部SSeCKS蛋白的量与静息状态比较差异显著,刺激90min后,SSeCKS大部分集中在细胞膜。结论1)TER联合倒置显微镜较倒置显微镜单独应用能更准确判定PMVECs单层融合状态;2)TER、Pd、LP均能有效检测PMVECs单层通透性变化,TER联合Pd更多地反映PMVECs通透性变化信息;3)SSeCKS表达增加上调PMVECs通透性在ALI/ARDS复杂机制中占重要地位,IL-1β、TNF-α和IL-17F是PMVECs高表达SSeCKS基因和蛋白的强有力诱导剂,PKC而非PKA、PTK信号通路参与其表达调控;4)IL-17F通过激活PKC-SSeCKS信号转导通路以及诱导PKC依赖的F-actin骨架重构来增加PMVECs通透性,从而促进肺部炎症反应。

全文目录

英文缩略词表  7-9
中文摘要  9-13
英文摘要  13-20
研究背景  20-23
第一部分观察肺微血管内皮细胞体外单层融合特征和评估细胞通透性  23-43
  1. 引言  23-24
  2. 材料和方法  24-33
    2.1 实验材料  24-25
    2.2 实验方法  25-33
      2.2.1 试剂配制  26-28
      2.2.2 RPMVECs 分离和培养  28
      2.2.3 RPMVECs 鉴定  28-30
      2.2.4 RPMVECs 通透性检测  30-32
      2.2.5 实验方案  32-33
    2.3 统计学处理  33
  3. 结果  33-40
    3.1 RPMVECs 特征  33-35
    3.2 Transwell 上RPMVECs 单层融合特征  35-38
    3.3 硝酸醋酸混合纤维膜上RPMVECs 单层融合特征  38-39
    3.4 静息状态RPMVECs 通透系数  39-40
    3.5 三种方法评估LPS 对RPMVECs 通透性的影响  40
  4. 讨论  40-43
第二部分 src 抑制的蛋白激酶 C 底物调控大鼠肺微血管内皮细胞通透性  43-79
  1. 引言  43-44
  2. 材料与方法  44-62
    2.1 实验材料  44-46
    2.2 实验方法  46-62
      2.2.1 主要试剂配制  46-50
      2.2.2 MTT 法检测细胞活性  50-51
      2.2.3 RT-PCR  51-54
      2.2.4 Western-blotting  54-57
      2.2.5 PKC 底物蛋白磷酸化检测  57-58
      2.2.6 RPMVECs 转染  58-61
      2.2.7 其他实验方法  61
      2.2.8 实验方案  61-62
    2.3 统计学处理  62
  3. 结果  62-74
    3.1 不同浓度BIM、H89 和金雀异黄素对RPMVECs 活性的影响  62-63
    3.2 IL-1β、TNF-α激活RPMVECs 的PKC 信号通路  63-64
    3.3 IL-1β、TNF-α刺激增加RPMVECs 中SSeCKS 基因和蛋白表达  64-65
    3.4 BIM、H89 和金雀异黄素对炎症因子诱导 RPMVECs 表达 SSeCKS 基因和蛋白的调控  65-67
    3.5 siRNA 转染RPMVECs 的特性  67-72
    3.6 SSeCKS 沉默和BIM 对炎症因子诱导RPMVECs 通透性变化的调控  72-74
  4. 讨论  74-79
第三部分蛋白激酶C 参与白介素-17F 诱导肺微血管内皮细胞通透性增加的调控  79-102
  1. 引言  79-80
  2. 材料和方法  80-89
    2.1 实验材料  80-81
    2.2 实验方法  81-88
      2.2.1 试剂配制  81-82
      2.2.2 SSeCKS 蛋白磷酸化检测  82-83
      2.2.3 RPMVECs 膜蛋白和细胞质蛋白分步提取和检测  83-85
      2.2.4 分析SSeCKS 蛋白与F-actin 骨架关联  85-86
      2.2.5 RPMVECs 的F-actin 染色  86-87
      2.2.6 其他实验方法  87
      2.2.7 实验方案  87-88
    2.3 统计学处理  88-89
  3. 结果  89-99
    3.1 不同浓度IL-17F对RPMVECs 活性的影响  89
    3.2 IL-17F 刺激对RPMVECs 通透性的影响  89-91
    3.3 PKC 抑制剂对 IL-17F 诱导 RPMVECs 通透性增加的影响  91-93
    3.4 IL-17F 及PKC 抑制剂对RPMVECs 中F-actin 的影响  93-95
    3.5 IL-17F 诱导RPMVECs 中SSeCKS 基因和蛋白表达  95-97
    3.6 IL-17F 诱导SSeCKS 蛋白部分生物学特征变化  97-99
  4. 讨论  99-102
全文结论  102-103
不足之处和工作计划  103
参考文献  103-114
附录 1 个人简历  114-116
附录 2 致谢  116-117
附录 3 综述  117-133

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病
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