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GKLF基因对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的实验研究

作　者: 严辉
导　师: 陈卫昌
学　校: 苏州大学
专　业: 消化内科学
关键词: 胃癌 胃肠富集Krüppel样因子 肠道富集Krüppel样因子 SGC-7901 基因转染
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


第一部分GKLF、IKLF在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及意义目的:研究胃癌组织和胃癌细胞株中GKLF、IKLF的表达及临床意义。方法:采用荧光实时定量PCR法检测胃癌组织和胃癌细胞株中GKLF mRNA、IKLF mRNA的表达,免疫组织化学法(IHC)检测胃癌组织及其远端正常胃组织中GKLF、IKLF蛋白的表达,Western blot和免疫细胞化学法(ICC)检测人正常胃上皮细胞株GES-1及胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27中GKLF、IKLF蛋白的表达。结果:胃癌组织中GKLF mRNA的相对表达量明显低于远端正常胃组织、IKLF mRNA的相对表达量明显高于远端正常胃组织(P <0.05)、胃癌组织中GKLF mRNA、IKLF mRNA的表达水平与组织分化程度无关,GKLF蛋白总阳性率显著低于远端正常胃组织、IKLF蛋白总阳性率显著高于远端正常胃组织(P <0.05),GKLF、IKLF蛋白表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、Lauren分型无关,与淋巴结是否有转移及pTNM分期有关(P <0.05);胃癌细胞株中GKLF mRNA和蛋白的相对表达量低于人正常胃上皮细胞株GES-1、IKLF mRNA和蛋白的相对表达量则高于细胞株GES-1(P <0.05)。结论:胃癌组织和胃癌细胞株中存在GKLF低表达、IKLF高表达,GKLF、IKLF在胃癌发生、发展中起一定的作用,检测GKLF、IKLF的表达有助于判断胃癌患者病情程度和预后。第二部分重组质粒pcDNA3.1-GKLF的转染及稳定细胞株的建立目的:建立高表达GKLF的稳定转染细胞株,以进一步观察其对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响。方法:用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-GKLF转染人胃癌细胞株SGC-7901,通过G418筛选,建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,用荧光实时定量PCR法、Western blot和ICC法检测GKLF mRNA和蛋白的表达。结果:建立了稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,成功地表达目的基因。结论:成功建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,为下一步探讨GKLF基因对胃癌生物学行为影响的体内外实验研究奠定基础。第三部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体外实验研究目的:体外观察外源性GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901增殖活性和侵袭力的影响,探讨GKLF在胃癌中的作用机制。方法:应用MTT法(四甲基偶氮唑蓝比色法)、流式细胞仪、克隆形成实验和体外细胞侵袭实验分别研究GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901增殖和侵袭活性的变化。RT-PCR法、Western blot法分别检测GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Ki-67、E-钙粘附分子(E-cadherin) mRNA和蛋白的表达。结果:与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比,SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞生长速度减慢、细胞出现G0/G1期部分阻滞、克隆形成率低、细胞侵袭力明显减弱(P < 0.05)。SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞Cyclin D1、Ki-67、E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平均低于SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组(P <0.05)。结论:GKLF基因可能通过下调Cyclin D1、Ki-67、E-cadherin的表达,而使人胃癌细胞株SGC-7901的增殖活性和侵袭力降低。第四部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体内实验研究目的:体内观察外源性GKLF基因转染对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长、转移的影响,并探讨GKLF在胃癌中的作用机制,从而为胃癌的基因治疗提供新的思路。方法:选用36只BALB/C-nu/nu裸鼠进行体内实验,分两批进行。每批裸鼠18只,各随机分为三组,每组分别注射等量的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF、SGC7901-pcDNA3.1和SGC-7901细胞(2×107个/200μl/只)。第一批,将细胞注射于每只裸鼠右胁腹前肢皮下,接种6周后处死裸鼠,观察肿瘤生长状况、成瘤潜伏期,IHC法检测裸鼠皮下移植瘤组织内GKLF、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达情况,测定皮下移植瘤组织中MVD值;同时用B超观察皮下移植瘤大小、血流信号及腹腔内转移情况。第二批,将细胞经尾静脉接种于裸鼠,接种6周后处死裸鼠,显微镜下观察有无肺转移。结果:与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比,SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组成瘤潜伏期延长、皮下移植瘤体积和瘤重较小(P <0.05),皮下移植瘤组织内GKLF蛋白表达升高、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达均降低,微血管密度(MVD)值降低。B超显示:SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组皮下移植瘤较小,血流信号I级。所有裸鼠均未见肺、腹腔转移。结论:GKLF基因可能通过下调Ki-67、E-cadherin、VEGF的表达,从而抑制肿瘤的生长,减少肿瘤中新生血管的生成,以GKLF为靶点的基因治疗有潜在的临床应用前景。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-13
引言  13-20
第一部分 GKLF、IKLF 在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及意义  20-48
  材料  20-25
  方法  25-31
  结果  31-41
  讨论  41-45
  参考文献  45-48
第二部分 重组质粒PCDNA3.1-GKLF 的转染及稳定细胞株的建立  48-63
  材料  48-50
  方法  50-54
  结果  54-59
  讨论  59-60
  参考文献  60-63
第三部分 GKLF 基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901 生物学行为影响的体外研究  63-76
  材料  63-64
  方法  64-68
  结果  68-72
  讨论  72-74
  参考文献  74-76
第四部分 GKLF 基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901 生物学行为影响的体内研究  76-93
  材料  76-77
  方法  77-80
  结果  80-89
  讨论  89-91
  参考文献  91-93
全文总结  93-94
综述 1  94-107
综述 2  107-115
全文缩略词  115-116
攻读学位期间公开发表的论文  116-117
致谢  117-118

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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