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Y染色体追踪大鼠骨髓间充质干细胞心肌移植的动物实验研究

作　者: 邢介龙
导　师: 徐长宪
学　校: 山东大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞心肌梗死模型 Y染色体细胞移植
分类号: R654.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：观察骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的原代及传代培养过程；建立Wistar大鼠心肌梗死的动物实验模型；利用Y染色体检测雄性大鼠的骨髓间充质干细胞移植到雌性大鼠心肌梗死模型中的存活情况；比较经静脉和心外膜注射两种移植方式对心肌梗死大鼠的心功能的影响。方法：(1)体外培养雄性Wistar大鼠的骨髓间充质干细胞：采用全骨髓贴壁筛选法原代培养,经过分离、纯化、扩增后,选取第3代骨髓间充质干细胞作为移植细胞。(2)大鼠心肌梗死(MI)动物模型的制备：选取100只雌性Wistar大鼠,通过开胸手术结扎左冠状动脉前降支(LAD)近端制备心肌梗死模型,经过心脏超声筛选,其中59只成功建立模型。(3)MI模型动物分组及细胞移植：MI模型大鼠于心肌梗死2周后,随机分为心外膜直接注射MSCs组(A组,n=20)、经静脉移植MSCs组(B组,n=20)和培养液对照组(C组,n=20)。其中A组再次行开胸手术,将MSCs细胞悬液用多点迷路注射的方法移植到心肌梗死边缘区；B组将MSCs细胞悬液经尾静脉推注；C组经静脉注射等量DMEM培养液。(4)检测移植的骨髓间充质干细胞在心肌梗死模型中的存活情况：通过普通PCR检测雄性大鼠Y染色体特有的sry基因,明确移植的MSCs在梗死周围的心肌组织中的定位情况；通过实时定量PCR (Real-time PCR)检测sry基因的具体数值,比较A、B两细胞移植组在移植后1d、1周、2周及3周时MSCs在梗死心肌的存活细胞数量。(5)心脏超声检测心功能A、B、C三组实验大鼠分别于移植前、移植后2周及4周分别测量左心室舒张末内径(LVEDD)及收缩末内径(LVESD),左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)等指标,比较三组大鼠移植前后心功能的变化情况。结果：(1)骨髓间充质干细胞的分离、纯化及鉴定：原代培养的骨髓间充质干细胞呈长梭形集落样生长,经传代后干细胞保持旺盛的生长及扩增能力,选取第3代骨髓间充质干细胞经流式细胞学检测显示,CD44阳性细胞92.1%±2.5%,CD90阳性细胞94.6%±2.1%；CD45、CD34均为阴性。(2)PCR检测到移植的雄性大鼠骨髓间充质干细胞存在于雌性大鼠心肌梗死周围组织中：A组(心外膜直接注射MSCs组)和B组(经静脉移植MSCs组)在移植后1周的雌性大鼠梗死心肌组织中均可检测到雄性供体骨髓间充质干细胞Y染色体的性别决定区即sry基因片段的存在,其PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果为阳性,而C组(培养液对照组)未检测到sry基因。(3)通过实时定量PCR (Real-time PCR)检测雌性MI模型大鼠心肌组织中sry基因的具体数值,间接反映不同时间段移植MSCs的存活数量：其中A组在移植后1d、1周、2周及3周时梗死心肌的存活MSCs细胞数量分别为4806±1943,734±213,163±43,147±33；B组在移植后1d、1周、2周及3周时梗死心肌的存活MSCs细胞数量分别为77±21,169±25,149±46,129±44。(4)超声心动图的心功能检测：与正常大鼠相比,A、B、C三组实验大鼠在心肌梗死后左心功能明显减退,心脏超声显示左心室扩大,左室前壁变薄,收缩活动减弱,LVEDD、LVESD增加,LVEF和LVFS减低。经干细胞移植手术后2周和4周复查心功能指标,C组LVEDD、LVESD呈进行性增加,LVEF、LVFS明显减低,心功能进一步恶化。与各组细胞移植前相比,A、B两组移植后LVEDD、LVESD分别有所减低,LVEF、LVFS有所提高,心功能得到不同程度的改善。结论：(1)通过心外膜直接注射和经静脉移植两种移植方式,雄性供体MSCs均可定位于雌性MI大鼠的心肌组织中。(2)通过实时定量PCR (Real-time PCR)能够检测不同时间段移植干细胞的存活数量,可以反映雄性供体MSCs在梗死周围心肌组织中的分布情况及动态变化。移植2-3周后,通过心外膜直接注射和经静脉移植MSCs均可稳定的分布在心肌梗死周边组织中,参与心肌组织的修复和心功能的改善,两组存活细胞数量差异无统计学意义。(3)骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠心肌梗死后心功能的恢复疗效确切,超声心动图检测MSCs移植后2-4周,心功能指标较移植前有明显改善,差异具有统计学意义。

Y染色体追踪大鼠骨髓间充质干细胞心肌移植的动物实验研究

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