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用三个氨基酸的感应器探测mSlo1孔道和β2亚基的相互作用位点

作　者: 李卉
导　师: 丁久平
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物物理学
关键词: BK通道 β2亚基 S6突变失活恢复非竞争模型
分类号: Q517
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

钙和电压激活的大电导钾离子通道(Maxik通道,又名BK通道)广泛地存在于可兴奋细胞,特别是神经系统中,具有调节胞内钙浓度和膜电位等重要生理功能。目前,人们对电压依赖的钾离子通道(Kv通道)的研究已较为深刻。BK通道与Kv通道在结构和功能上既存在某些相似之处又有各自的特点。如它们都能结合β辅助亚基,并通过其N端的疏水氨基酸引起N型失活。然而,BK通道的胞内阻断剂(如TEA、QX-314等)却不能像Kv通道那样减慢失活过程。因此,BK通道的α亚基在失活过程中如何与其β亚基的N端相互作用,它们的相互作用位点怎样,这些问题自被提出后至今仍未解决。我们将hβ2 N端的前三个氨基酸FIW突变为FWI,发现hβ2的突变体hβ2-FWI对α亚基的失活没有影响,但使其的失活恢复时间曲线从单指数转变为双指数特征。利用hβ2-FWI的这一特性,我们将α亚基形成孔道的S6区的疏水性氨基酸依次突变为不太疏水的丙氨酸。S6的突变体与FWI共表达来检测失活过程中hβ2亚基与α亚基孔道的相互作用位点。本课题的主要研究成果如下:(1)在S6突变中,mSlo1-I323A与hβ2-FWI共表达,它们的失活恢复双指数成分中的慢相得到最大地消减,即能最好拟合成单指数恢复曲线,说明I323是在失活过程中与β2亚基相互作用的主要位点。另外,M314A和V319A的快相变得异常地快,说明这两点也在失活过程中起着一定的作用。根据FWI的线性结构关系,我们推测如下的相互作用关系:I323-I,V319-W,M314-F;I323起着主导性的作用。(2)虽然V319A对QX-314的敏感性强于其他位点,但QX-314在孔道内并没有特异性的结合位点。我们提出了一个非竞争模型。I323是孔道内的最后一个氨基酸,既β2 N端失活域的作用位置是在孔道口,而QX-314的作用位置位于孔道内,因此QX-314不会影响β2引起的失活过程,这就解释了胞内阻断剂为什么不减慢BK通道的失活。这为进一步了解BK通道的结构和门控机制提供了重要的实验和理论支持。(3)I323A不管是单通道还是宏观电流都有外向整流现象,而野生型的mSlo1没有;I323A的单通道出现非常像噪声的电流,就像dSlo1A的单通道电流一样。这说明了Ile-323还调节BK通道的门控。在dSlo1A上与之对应的氨基酸是Thr-337。Ile是疏水氨基酸,而Ala和Thr都是亲水氨基酸。我们把野生型mSlo1的Ile-323突变为Thr,发现I323T导致与dSlo相似的噪声单通道电流。这个机制可能帮助我们了解dSlo1A单通道的行为。(4)计算机模拟mSlo1孔道与β2 N端相互作用的结构,得到了部分可供参考的两蛋白分子共价键之间相互作用的细节。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
1 绪论  9-45
  1.1 引言  9-10
  1.2 离子通道简介  10-15
  1.3 晶体结构的解析掀起了钾离子通道结构和功能研究的热潮  15-26
  1.4 电压依赖型钾通道的失活及其分子机制  26-36
  1.5 BK 通道的结构和功能  36-44
  1.6 本文研究的目的  44-45
2 mSlo1 和 hβ2 突变体的获得  45-65
  2.1 引言  45
  2.2 实验材料  45-46
  2.3 实验方法  46-63
  2.4 实验结果与分析  63-65
3 寻找 hβ2 N 端与 mSlo1 相互作用的位点  65-97
  3.1 引言  65-66
  3.2 实验材料  66-67
  3.3 实验方法  67-84
  3.4 实验结果与分析  84-97
4 mSlo1 与 hβ2 N 端蛋白质相互作用的计算机模拟  97-102
  4.1 引言  97
  4.2 实验方法  97-99
  4.3 实验结果与分析  99-102
5 全文总结  102-104
  5.1 本文的创新点  102-103
  5.2 本文的主要结论  103-104
致谢  104-105
参考文献  105-118
附录I 攻读博期间撰写的文章  118-119
附录II 主要符号和缩略词表  119

用三个氨基酸的感应器探测mSlo1孔道和β2亚基的相互作用位点

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